神经系统退行性疾病基因治疗的研究进展

丁 婧 赵琳琳 曲 扬 高 腾 杨滨瑞 张惊宇

(哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科，哈尔滨 150001)

神经系统退行性疾病是一类原因尚不十分明确的慢性进行性损害神经等组织的疾病，表现为神经元进行性变性及坏死，引起认知、情绪及行为异常，代表疾病包括帕金森病(Parkinson′s disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)以及肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。当前临床对于神经退行性疾病的治疗仍以对症治疗为主，尚缺少针对病因的可以逆转疾病的有效治疗方法。而基因治疗则被认为是目前治疗神经退行性疾病的有力工具[1]。如何使基因真正靶向作用于神经系统并且达到一定转导效率仍是基因治疗必须要解决的问题。同时，基因治疗涉及的复杂实施步骤以及未来临床试验中面对的伦理问题都需要不断探索与解决，从试验研究到临床应用仍需要漫长过程。尽管如此，基因治疗仍以其早期精准诊断的极大优势与良好的应用前景吸引着越来越多的研究者参与其中。目前常用的基因治疗的病毒载体包括腺相关病毒载体(AAV)和慢病毒载体[2]。本文对神经系统几个代表性退行性疾病的基因治疗的研究进展进行综述，以期为神经系统退行性疾病的基因治疗提供理论依据。

1 帕金森病

PD是一种神经退行性疾病，其特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丧失和纹状体多巴胺水平的降低，其症状主要包括僵硬、静息性震颤和运动功能损害(如运动迟缓)。20世纪后期发现，在希腊、德国和意大利的个别家族性PD患者中存在α-突触核蛋白基因突变，截至目前，已经发现了至少有10个单基因与家族性帕金森病连锁的基因位点。同时，基因易感性也可导致PD患病概率增加。目前的治疗标准包括用左旋多巴和深部脑刺激(DBS)等替代多巴胺。左旋多巴能以不同的效率恢复某些运动功能，但随着PD的进展，左旋多巴的疗效亦不尽如人意，且其副作用变得更加明显，而DBS虽可减轻PD的症状，但没有针对其病因，此外，DBS亦可加剧患者认知和情绪恶化，这是晚期PD的特征[3]。基于此，基因治疗PD的可能性则被广泛探讨。又有研究表明，在盲Ⅱ期临床试验中唯一显示疗效的试验是通过直接注射到丘脑底核(NCT00643890)的方式释放AAV2谷氨酸脱羧酶(GAD)，且与对照组相比，接受AAV2-GAD治疗的患者症状有所改善[4]。有实验表明，AAV2将NRTN(Cere-120)输送到壳核以支持多巴胺能神经元(NCT0040634)，分析Ⅱ期试验患者死后脑组织发现，虽然纹状体/壳核注射区的NRTN表达增加，但黑质没有相应的增加，这被认为是由于多巴胺能神经元的逆行运输失败所致[5]。而对于这种结果，后期亦有实验研究表明，在实验中同时注射壳核和黑质，并随着壳核传导的增加而增加剂量，结果显示该策略显著增加了NRTN的表达[6,7]。Quintino等[8]对啮齿动物PD模型测试结果表明，甲氧苄啶可能穿过血脑屏障并与DD结构域结合，并可调节GDNF的表达，以此保护神经元并改善运动功能，然而值得注意的是，这些动物的基因治疗是在PD诱导PD前进行的，有必要对已经出现PD症状的动物进行进一步研究，以确定其治疗效果。

2 阿尔茨海默病

AD是一种进行性神经退行性疾病，其特征是记忆、思维和行为障碍，疾病进展与胆碱能神经元变性和淀粉样蛋白β(Aβ)斑块的形成有关。家族性AD最常见的基因突变包括21号染色体淀粉样前体蛋白基因，14号染色体早老素1基因以及1号染色体早老素2基因，此三种基因突变均能够导致Aβ的过度形成。散发性AD截至目前研究肯定与其有关的为载脂蛋白E基因。

2.1降低Aβ水平 家族性AD是由Aβ前体蛋白(APP)基因突变或蛋白酶将前体蛋白切割成片段引起的，在治疗方面主要采用胆碱酯酶抑制剂，可在一定程度上缓解AD患者的症状[9,10]。有学者研究了AD斑块形成、细胞凋亡以及使用生长因子等过程，结果显示抑制斑块形成的一个重要方式是降低大脑中Aβ和Tau的水平，而一种表达miRNA的AAV可降低AD的3转基因小鼠模型中的Aβ水平，即胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)[11,12]。又有研究指出，将含有leptin基因(LEP)的慢病毒载体ICV注射到双转基因AD小鼠体内，导致Aβ负和tau磷酸化降低，突触密度提高[13]。而在AD小鼠海马齿状回注射一种表达卷蛋白同源物F-spondin(SPON1)的慢病毒载体，可改善其记忆和学习，降低Aβ斑块沉积水平，说明慢病毒载体可有效改善AD小鼠的记忆以及学习，对AD有较好的干预作用。

2.2降低Tau磷酸化 有研究表明，早期AD患者海马中的瘦素减少，而含有瘦素基因(LEP)的慢病毒载体ICV注入双转基因AD小鼠体内，可降低Aβ负荷降低Tau磷酸化，提高突触密度，说明瘦素基因亦可通过干预Aβ以及tau磷酸化而有效改善AD的发生[14]。复有研究发现，在AD发生的早期，其脑内则可见Tau的过度磷酸化，且可高于正常水平的3～4倍，并导致Tau蛋白从微管蛋白上脱落，进而引起神经细胞变异，且脱落的Tau蛋白又可因构象的改变而引起亲和力的升高，并将单体变为可溶性寡聚体，并致使原纤维丝甚至是AD的病理标志物NFT的形成，说明只有降低Tau的过度磷酸化才可有效改善AD的发生与发展[15]。

2.3降低caspase-3水平 研究指出，在小鼠脑内注射铝诱导凋亡后，对表达shRNA抗caspase-3(CASP3)的慢病毒载体进行了检测，结果发现，慢病毒shRNA抗CASP3导致caspase-3水平降低，细胞死亡，学习以及记忆功能改善，这说明慢病毒shRNA抗CASP3可有效改善AD患者的学习及记忆的能力[16]。又有研究表明，在AD的动物模型中发现，皮层和海马神经元的大量减少为主要的病理特征[17]，这可能与细胞凋亡有一定的关系，而细胞凋亡参与细胞分化、胚胎发育及细胞更新，其细胞凋亡机制发生障碍可导致多种疾病，且细胞凋亡因子caspase-3 和caspase-8基因的高表达可导致动物体脑内神经元的凋亡，且Aβ42 的二聚体和/或四聚体等低聚物能够显著升高谷氨酸水平，亦引起神经元的坏死，这说明对细胞凋亡因子caspase-3和caspase-8基因的干预可有效保护神经元，进而抑制AD的发生与发展。

3 肌萎缩性侧索硬化

ALS，也称为卢·格里格病，是一种进行性的、致命的神经退行性疾病，由于大脑、脑干和脊髓上下运动神经元丧失导致，通常在2～5年内死亡，ALS可表现为散发性的，亦可表现为家族性的，且与许多基因和疾病的发展有关[18]。此前研究表明，约20%的家族性ALS和2%的散发性ALS与铜(锌)超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变有关。近年发现，1号染色体TAR DNA结合蛋白基因突变与家族性ALS及散发性ALS均有关联。9号染色体C90RF72基因非编码区GGGGCC 6核苷酸重复序列与25%左右的家族性ALS相关。对于家族性ALS而言，通过靶向特定的突变来进行ALS的基因治疗尤为重要，且改变受影响基因的表达也已被证明是有效的，而这种方法主要是对最先被鉴定为可引起ALS突变的SOD1基因进行了测试，方法为将反义寡核苷酸(ASOs)输注到SOD1鞘内进行试验(NCT0041222)，但单用ASOs的缺点是需要持续输注或重复给药，而使用病毒载体传递ASO或短发夹shRNA可以避免这个问题，且结果显示AAV9-SOD1-shRNA可有效降低大鼠模型中SOD1基因的表达，说明AAV9-SOD1-shRNA为ALS基因治疗的新方向。研究表明，鞘内注射表达单链抗体的AAV9以对抗错误折叠的SOD1的方法可有效延迟过度表达突变形式SOD1的转基因小鼠的发病并延长寿命[19]，同时亦指出其有可能应用于其他已知的引起突变的ALS，说明鞘内注射表达单链抗体的AAV9对ALS具有一定的疗效。有研究表明，miRNA 155在SOD1小鼠和人ALS脊髓标本中的表达增加，通过寡核苷酸阻遏物抑制miRNA 155在SOD1小鼠中的表达，可延长生存期和疾病持续时间，这说明抑制miRNA 155可有效抑制AD的进一步发展[20]。

4 结语

常见的神经系统疾病多表现为神经退行性的病变，而目前针对神经退行性疾病的治疗仍是难题，临床上以对症综合治疗及护理为主，缺少有针对性的治疗方案与手段。研究发现多种神经系统退行性疾病是由于基因突变引起，如果能够从疾病基因发病机制上对其进行早期诊断和干预即采取基因治疗手段，其优势显而易见。初步试验表明，将基因治疗药物输送到中枢神经系统是安全和耐受的，而为了改善传递效率，新的载体也已经被识别和开发。AAV9就是其中之一，其可以穿过血脑屏障，具有很强的神经元倾向性。而病毒载体的另一个值得注意的进展是ProSavin基因治疗试验中使用的多顺反子慢病毒载体，也可成为基因治疗中有效的载体。同时亦有另一个正在取得进展的基因治疗领域是向中枢神经系统直接提供基因治疗的方法，如ICV、鞘内注射和直接注射到大脑和脊髓中的递送方法，且一直在不断的研究发展和完善之中。

本综述从神经系统退行性疾病PD、AD以及ALS 3种具有代表性的疾病着手进行总结与论述，以求更好地了解神经退行性疾病的病因，进而可以对其做出早期诊断，为靶细胞丢失之前进行干预提供可能，鉴于上述疾病的试验结果推测，在出现明显症状、靶细胞丢失之前对疾病进行治疗，可能会影响治疗效果。这些进展的结合将有助于将新的基因疗法应用于临床，从而在治疗此类神经系统退行性疾病方面取得真正的进步。