肺癌微环境细胞分类研究进展

麦晓君 周凤丽

(中山大学附属第三医院，广州 510630)

原发性肺癌是最常见的肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势。由于其发病隐匿，临床影像学发现的结节性病变多根据结节大小及形态、有无肺癌危险因素等建议患者3个月至1年复查胸部CT(影像学随访策略：2018年版肺结节诊治中国专家共识)，但由于部分患者依从性较差，未规律复诊，且部分肺癌进展较快，以至于多数肺癌发现时已是晚期。因此，肺癌患者的早期诊断对患者的预后至关重要。近年来，肿瘤免疫成为肿瘤领域的热点。许多研究通过各种检验方法对比肺癌微环境与肺部良性疾病中各种免疫细胞的比例以发现其中的差异，或对肺癌的早期诊断有所帮助。同时，各种免疫细胞对肿瘤的作用各不相同，一些免疫细胞可通过促进肿瘤血管形成参与肿瘤的生长、转移，而另一些免疫细胞则可通过发挥直接肿瘤杀伤、募集其他免疫细胞等方式发挥抗肿瘤作用。通过研究发现各种免疫细胞在肿瘤的侵袭转移中所发挥的作用，可为肿瘤的治疗提供新的靶点。

1 肺癌微环境中的适应性免疫细胞

1.1T淋巴细胞亚群 肿瘤患者常处于免疫低下状态，肿瘤细胞通过一系列机制逃避机体免疫系统的对抗。而肺癌患者中T淋巴细胞常为主要的免疫细胞。其中CD4+T淋巴细胞为重要的辅助性细胞，可通过分泌多种细胞因子促进免疫反应；而CD8+T淋巴细胞则是通过直接杀伤作用，清除被病毒或细菌感染的细胞及表达特异性新抗原的肿瘤细胞。肺癌患者的肿瘤微环境常出现一系列免疫紊乱，包括CD4+降低、CD8+升高，CD4+/CD8+降低。相比于肺结核及其他肺感染性疾病患者，肺癌患者肺泡灌洗液CD4+不同程度降低，CD8+不同程度升高，CD4+/CD8+降低；而良性肺部疾病患者恰好相反，如结节病患者，CD4+明显升高，CD8+降低，CD4+/CD8+升高；特发性间质性肺炎患者则是CD4+、CD8+及CD4+/CD8+接近于正常。因此，可设想通过流式细胞术检测肺泡灌洗液中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+对患者评估T细胞免疫状态，有利于肺癌及其他肺部疾病的早期诊断[1]。另外，T淋巴细胞参与了机体的细胞免疫，而其中的调节性T淋巴细胞(regulatory T cells，Tregs)在机体抵抗肿瘤的防御机制中发挥重要作用。Tregs可以通过抑制T淋巴细胞、树突状细胞及自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)的活性维持免疫耐受。有研究标记表达CD4+/CD25high/FoxP3+/CD127-的Tregs，使用流式细胞学检测肺泡灌洗液中Tregs含量，发现肺癌患者的肺泡灌洗液中Tregs含量高于良性病变患者。且在非鳞状细胞类型肺癌(尤其是腺癌)的肿瘤微环境中，肺泡灌洗液中的Tregs比例高于肺鳞状细胞癌患者。由此研究可以推测，通过检测肺泡灌洗液中Tregs的比例，可以分析肺癌患者肿瘤微环境的局部免疫状态，有利于肺癌免疫治疗的开展，并在一定程度上可以在抗肿瘤免疫治疗前预测其预后[2]。除了可通过检测T淋巴细胞亚群的比例及计数早期诊断肺癌，T淋巴细胞对肺癌的治疗也有重要意义。刘睿等[3]总结了抗原嵌合受体T细胞(CAR-T)经历的四代变革、治疗肺癌所出现的副作用、治疗肺癌的多个靶点，包括内皮生长因子受体(epidermal growth receptor，EFGR)、酪氨酸激酶受体(EphA2)、黏蛋白(mucoprotein1，MUC1)、人类表皮生长因子2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)。

1.2B淋巴细胞 瘤内B淋巴细胞同样是肺癌微环境免疫细胞的重要组成之一 。体内B淋巴细胞既有抗肺癌作用，亦有促进肺癌细胞生长及转移的作用。有研究发现，体内循环中的B淋巴细胞可分泌炎症因子并通过分化成为Be1、Be2两种亚型分别产生与Th1、Th2细胞相似的细胞因子谱，从而调节Th1∶Th2比例，参与肿瘤发展过程[4-6]。其中，鳞状细胞性肺癌通过鳞状细胞癌抗原等肿瘤相关性抗原刺激体内循环中的B淋巴细胞产生抗体并形成循环免疫复合物(CIC)，而CIC能激活骨髓细胞的FcγR信号通路，募集体内白细胞至肿瘤微环境来帮助肺癌的转移及生长[7]。由此推测，通过抑制B细胞活化或阻断B细胞介导的固有免疫细胞募集的药物干预可有效预防癌前病变的发展。然而瘤内B淋巴细胞对肺癌起抗肿瘤作用。瘤内B淋巴细胞可诱导细胞免疫应答分化、促进CD4+T记忆细胞形成、增强活化CTLs的增殖和存活，由此发挥抗癌作用。另外，瘤内B淋巴细胞还存在一种新功能：诱导和维持肿瘤内三级淋巴结构。此淋巴结构在抗肿瘤中发挥重要作用，并与肿瘤的预后相关。通过向癌灶中转移CXCL13和淋巴毒素等细胞因子可刺激瘤内B淋巴细胞和三级淋巴结构的形成，协助其他免疫细胞进入肿瘤内，以此产生保护性免疫作用，为提高肿瘤疫苗的效率提供了理论依据[8]。另有实验发现，部分肺鳞状细胞癌及高分化腺癌的瘤内B淋巴细胞通过分化浆细胞并分泌IgG4发挥抗肿瘤作用[9]。在肺癌刺激下，瘤内B淋巴细胞可产生特异性抗体并形成原位免疫复合物，以此杀死肿瘤细胞。Michael等[10]研究发现，非小细胞肺癌的癌巢中存在着肿瘤生发中心。而瘤内B淋巴细胞多位于肿瘤生发中心，通过流式细胞学等技术提取其中的记忆B淋巴细胞，克隆其轻链及重链的产物或可寻找治疗肺癌的新靶点[11]。此外，有研究发现，瘤内B淋巴细胞具有直接杀伤肿瘤的能力，其可通过TRAIL/Apo1信号通路介导杀伤体外肿瘤细胞[12]。

2 肺癌微环境中的固有免疫细胞

2.1肺癌微环境中的巨噬细胞 巨噬细胞也是人体免疫系统的重要成员，其可分为M1型及M2型。其中M1型为经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)，主要通过IFN-γ、TNF或LPS诱导，可高水平表达肿瘤坏死因子、IL-12、IL-23等炎症因子，诱发Th1型免疫应答，具有促炎症和抗肿瘤作用；而M2型则为替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage)，由IL-4或IL-13等诱导，可分泌IL-10和多种趋化因子，主要诱导Th2型免疫反应，参与细胞生长、血管生成、免疫抑制、组织修复和间质形成等过程[13]。肺癌微环境中的巨噬细胞以M2型巨噬细胞为主，有研究表明，M2型巨噬细胞可能通过诱导上调VEGF-C及其特异性受体VEGFR3的表达促进肿瘤细胞的侵袭和转移。而VEGFR3是近年来研究较多的与血管和淋巴管的生长发育相关的受体，尤其是对淋巴管的生长发挥重要作用[14]。M2型巨噬细胞还可通过产生一些酶(如MMP-2等)调整肿瘤微环境的代谢，而这些酶的活性与肿瘤的侵袭性相关，参与肿瘤的转移[15]。另外，M2型巨噬细胞还可分泌IL-10等细胞因子抑制免疫应答，并降低TNF-α、IL-12、IL-1等免疫刺激因子表达从而促进肿瘤生长[16，17]。因此，通过对肿瘤微环境中巨噬细胞的分类及计数可对肿瘤的早期诊断及预后有所帮助。有研究表明，CD163+M2型巨噬细胞增多是NSCLC进展的独立危险因素。可通过检测CD163+M2型巨噬细胞的计数了解肿瘤的进展。此外，该研究推测，NSCLC细胞或通过表达VEGF招募M2型巨噬细胞，可通过抗VEGF单克隆抗体(贝伐单抗)抑制肿瘤血管形成，阻止M2型巨噬细胞的募集[18]。此外，基于对M2型巨噬细胞的治疗策略还包括：①抑制趋化因子配体2、7、8，阻止肿瘤相关巨噬细胞聚集；②阻止巨噬细胞向M2型极化；③逆转M2型巨噬细胞的表型[19-21]。

2.2肥大细胞 肥大细胞也是固有免疫细胞的重要一员。循环中的肥大细胞对许多肿瘤而言起着促进其生长及转移的作用。例如，肥大细胞可以通过促进肿瘤血管形成、自分泌局部激素介质及分泌各种生长因子促进肺腺癌及肺鳞状细胞癌细胞的转移及生长[22-25]；其脱颗粒过程中的产物可促进宫颈癌细胞的转移[26]；并且其释放的组胺与结直肠癌的恶变程度相关[27]。另有研究表明，瘤内肥大细胞在NSCLC的癌巢基质细胞中占有优势，并与NSCLC的生存率相关[28]。该研究表明，人体内肥大细胞具有两种表型，其中一种含有类胰蛋白酶(MCT)，而另一种包含类胰蛋白酶及糜酶(MCTC)。MCT主要位于黏膜上皮及固有层中，而MCTC主要位于皮肤及结缔组织中。瘤内的此两种表型对于NSCLC的生存率均有改善，提示肥大细胞能参与到抗肿瘤免疫过程中。肥大细胞可通过分泌TNF-α促进T淋巴细胞增殖，而通过TNF-α促进生长的T淋巴细胞又可正反馈促进肥大细胞增殖，两者共同发挥抗肿瘤作用[29]。另外，肥大细胞可通过脱颗粒释放蛋白酶破坏肿瘤基质，肿瘤细胞外基质及细胞结构受到破坏，从而抑制肿瘤的生长[28]。

2.3树突状细胞 树突状细胞(dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟的DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始T细胞，处于启动、调控、维持免疫应答的中心环节。DC通常少量分布于与外界接触的皮肤(黏膜)部位，主要为皮肤、鼻腔、肺、胃与肠的内层。血液中也可发现未成熟型DC。当其被活化时，会移至淋巴组织中与T细胞和B细胞互相作用，刺激相应的免疫反应。有研究发现，经过基因修饰的DC可通过CCL21趋化吸引幼稚T淋巴细胞聚集，并分化为肿瘤特异性的T淋巴细胞对抗肿瘤[30]。此外，DC可通过分泌CCL1、CCL17促进CD8+T淋巴细胞的活化[31]。除经典的DC外，还有一种浆细胞样DC(plasmacy-toid dendritic cells，pDCs)，其可通过抗原呈递，调节NK细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞平衡，具有联系固有免疫及适应免疫的作用。此外，在不同细胞因子作用下，pDCs既可诱导免疫耐受，亦可发挥免疫刺激作用。用具有抑制作用的配体CTLA4-Ig或OX2(CD200)刺激pDCs，可诱导机体产生吲哚胺2,3-双加氧酶，进而抑制T淋巴细胞增殖，产生免疫耐受[32]。许多肿瘤瘤内有大量未成熟的DCs及pDCs浸润，与肿瘤的转移、复发相关。有研究发现，表达于pDCs的ICOS配体可通过聚集具有免疫抑制作用的CD4+T淋巴细胞促进乳腺癌生长[33]。另有研究发现，TLR激动剂可促进肿瘤瘤内浸润的pDCs产生IFN-1，并激活瘤内未成熟DCs诱导具有抗肿瘤作用的T淋巴细胞的免疫反应并发挥抗血管生成作用。此研究通过使用咪唑喹啉作用于pDCs，调节T淋巴细胞发挥抗黑色素瘤的作用[34]。而pDCs在肺癌方面的研究较少，有待进一步探索。

2.4自然杀伤细胞 NK细胞是一种大颗粒淋巴细胞，它可在无需抗原预敏的情况下、非MHC限制的识别并杀死肿瘤细胞及病原体感染的细胞，是机体重要的免疫细胞之一，也是非特异性免疫的重要一员。有研究发现，肺癌微环境中的NK细胞浸润程度与原发性肺癌的病理类型、肺癌患者的吸烟史、肿瘤大小及肿瘤预后相关[35]。NK细胞在肺鳞状细胞癌的浸润高于肺腺癌；有吸烟史的肺癌患者的癌巢NK细胞浸润少于无吸烟史患者；肺癌癌灶越大，NK细胞浸润越多，肺癌患者预后越好。在肺癌肿瘤微环境中，NK细胞的抑制性受体显著升高，而刺激性受体明显下降。该研究通过小鼠实验推测，NKG2D、Ly49I的下调及NKG2A的上调或与肿瘤免疫耐受的产生相关。其中，NKG2A是NK细胞的抑制性配体受体；而NKG2D是NK细胞及T淋巴细胞的刺激性受体，其识别可辅助肿瘤免疫监督并通过触发穿孔素介导的细胞凋亡作用发挥抗肿瘤作用；Ly49I亦是NK细胞上的刺激性受体，其可帮助NK细胞溶解肿瘤细胞。周智锋等[36]用Ficoll分离得到外周血单个核细胞，按IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合方案培养获得NK细胞，对比NSCLC患者化疗及化疗联合NK细胞回输治疗效果发现，联合NK细胞回输治疗的中位生存期高于仅使用化疗治疗，并且通过检测肿瘤组织中NK细胞刺激性受体NKG2D的配体——MICA表达可预测NK细胞回输治疗的疗效。还有研究通过吉非替尼作用于肿瘤微环境中的NK细胞，增强其对肺癌肿瘤细胞的细胞毒性发挥抗肿瘤作用[37]。早期曾有研究使用IL-2刺激NK细胞发挥抗肿瘤作用，但由于IL-2的毒性及受IL-2驱动的Treg扩增的限制而失败[38]。因此，要使用NK细胞发挥抗肿瘤作用必须解决以下问题：①阻断抑制NK细胞活化的抑制性受体；②消除抑制NK细胞功能的Treg；③使NK细胞有机会进入实体肿瘤内；④中和肿瘤细胞分泌的抑制性因子，如TGF-β；⑤消除髓源性抑制性细胞(MDSCs)；⑥提供NK细胞活化、刺激增殖及存活所必须的细胞因子和生长因子[39]。近年来，NK细胞抗肿瘤的研究也取得了一定的进展。有实验通过刺激NK细胞表达肿瘤相关嵌合抗原受体发挥抗肿瘤作用并取得成功[40]。另外，有实验通过设计双特异性蛋白，其中一个臂与肿瘤抗原结合，另一个臂与激活的NK细胞受体结合，通过此种交联刺激NK细胞发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用定向裂解肿瘤细胞[41]。

综上所述，通过研究肺癌微环境中免疫细胞的计数、比例及其在肿瘤发生发展中的作用，可为肺癌的早期诊断、预后判断及靶点选择提供重要参考。当然，其中仍有部分问题需要解决，各种免疫细胞的互动网络及不同细胞因子对不同免疫细胞的作用仍需要进一步研究，这也将为肿瘤免疫治疗开启新篇章。