RNA结合蛋白HuR的研究进展及其在肝细胞癌发生发展中的作用*

苏 莹，金 春，孙苏敏，李章昊，夏思伟，张自力，2，3，张 峰，2，3，邵江娟，2，3△，郑仕中，2，3△

［南京中医药大学 1江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2江苏省中药功效物质重点实验室，3中药品质与效能国家重点实验室（培育），江苏南京210023］

转录后事件，特别是mRNA 翻转和翻译的改变，是哺乳动物细胞在应激反应中控制基因表达的主要机制。mRNA 稳定性和翻译的变化主要是通过特定mRNA 序列（顺式元件）与两种主要的反式作用因子——RNA 结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）和微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用而启动的过程来控制的［1］。RBP 参与RNA 代谢的各个环节，包括RNA 剪接、多聚腺苷酸序列编辑、RNA 转移、维持RNA 的稳定和降解、细胞内定位和翻译调控等。胚胎致死性视觉异常（embryonic lethal abnormal vi⁃sion，ELAV/Hu）家族蛋白是唯一通过识别3´端非翻译区（3´-untranslated region，3´UTR）中的富含AU 元件（AU-rich element，ARE）来稳定mRNA的RBP。多数Hu 蛋白家族成员（Hu-B、C 和D）只在中枢神经系统表达，HuR（ELAVL1）是唯一在人类中广泛表达的成员［2］。本文总结HuR 的功能，并介绍其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）方面的研究进展，以期为未来HCC的治疗研究提供新的可能靶点。

1 HuR的主要功能

HuR 是目前研究较为广泛的转录后基因表达调控因子之一，在炎症、肿瘤、细胞凋亡、细胞增殖和血管生成中发挥重要作用。HuR 蛋白由3 个RNA 识别基序（RNA recognition motif，RRM）和1 个柔性铰链区组成，RRM 主要识别靶mRNA 3´UTR 中的ARE，以稳定这些mRNA 并促进它们的翻译。HuR 是一种核质穿梭蛋白，主要定位于细胞核；在各种刺激（如病毒感染、细胞因子、热休克和紫外线照射）下，HuR移位到细胞质，这是其稳定mRNA 功能所必需的［3］。HuR实现这些效应潜在机制是HuR通过与其他限制性RBP（如tristetraprolin，TTP）和miRNA 竞争来防止靶mRNA 降解。目前，许多因子已被证明是HuR的下游靶点，尤其是细胞因子、肿瘤因子和炎症因子。因此，HuR 表达增加或核浆分布异常总是伴随着炎症的加重和肿瘤的不良转化。

1.1 稳定靶RNA 大量的mRNA，如环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、白细胞介素8（interleu⁃kin-8，IL-8）、趋化因子CCL2、趋化因子CCL8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和细胞周期蛋白（cyclin）的mRNA 被鉴定为HuR 靶点。通过这种方式，HuR 参与了生物过程的许多方面，如炎症和肿瘤进展。

TNF-α/钙网蛋白（calreticulin，CRT；内质网常驻蛋白，负责维持Ca2+稳态和糖蛋白折叠）双信号通路可诱导类风湿关节炎大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization do⁃main-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体激活，并与HuR 核质穿梭有关。TNF-α（信号1）通过诱导HuR 由胞核移位到胞浆，稳定NLRP3 mRNA，从而促进NLRP3蛋白表达；在CRT（信号2）作用下，NLRP3寡聚体形成，引起caspase-1 裂解，进而触发IL-1β 的裂解分泌［4］。SNAIL 是一种转录因子，它能抑制Ecadherin，并激活N-cadherin，在胚胎发育和细胞迁移期间调节上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［5］。HuR 能够与SNAIL mRNA 结合并使其稳定，增加了EMT，从而促进了肿瘤细胞的迁移［6］；SNAIL mRNA 上ARE1 的缺失降低了SNAIL mRNA 的稳定性，表明HuR 通过ARE1 与SNAIL 的3´UTR 结合从而起到稳定其mRNA 的作用。另有研究表明，HuR 还能调节细胞增殖过程中cyclin A 和cyclin B1 mRNA 的稳定性［7］。HuR 通过上调cyclin A和cyclin B1 mRNA 的半衰期来调控cyclin A 和cy⁃clin B1表达。这说明HuR可能在细胞增殖中发挥关键作用，至少部分是通过调控细胞周期依赖性的cy⁃clin A和cyclin B1 mRNA的稳定性。

HuR 保护mRNA 免于降解的确切机制尚不清楚，然而人们普遍认为，HuR与靶mRNA的结合可以阻止其他RBP或miRNA［与RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）或内在核糖体进入位点（internal ribosome enter site，IRES）相关］与其结合［8］，这些RBP 或miRNA 能够将mRNA 重新募集到mRNA降解的位点，如外泌体或加工体［9-10］。

1.2 促进靶mRNA 翻译 HuR 还促进几个编码参与疾病过程蛋白的靶mRNA 的翻译，包括cyclin A2、胸腺素原α（prothymosin-α，Prot-α）、缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板应答蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）、p53、阳离子氨基酸转运体1（cationic amino acid transporter-1，CAT-1）、X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）、细胞色素C 等。目前还不清楚HuR如何促进这些靶mRNA 的翻译，但有证据表明HuR促进XIAP 翻译与XIAP 5´UTR 的IRES 相关。XIAP的胞内水平受多种不同的机制调控，但主要的调控机制还是在翻译起始阶段。XIAP mRNA 的5´UTR含有一个IRES 基序，当整体cap 依赖的翻译受到损害时，该基序在细胞应激条件下驱动有效的XIAP mRNA 翻译［11］。HuR 在体内外均能与XIAP 的IRES结合，并直接增强XIAP 翻译［12］。有研究表明，HuR还可通过上调自噬相关蛋白ATG7和ATG16L1，促进自噬小体的形成来调节缺氧诱导的自噬［13］。此外，于文燕等［14］的研究证实，HuR 还可以与IκB-α mRNA 的3´UTR 特异性结合，通过促进IκB-α 的翻译来调节其生物学功能，为进一步研究其在NF-κB 通路中发挥的重要作用提供了理论依据。

在HuR 上调翻译表达的一些实例中也有报道HuR 诱导的从靶mRNA 中排除翻译抑制子（其他TTR-RBP 或miRNA/RISC）的模型。促炎抑癌蛋白程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）在维持炎症和肿瘤发生之间的平衡中起着重要作用。PDCD4 mRNA的翻译被致癌的miR-21抑制。Poria 等［15］证明HuR 能与PDCD4 的3´UTR 相互作用，阻止miR-21 与其结合，进一步介导PDCD4的翻译抑制。稳定表达miR-21 的细胞表现出较高的增殖能力和较低的凋亡率，而HuR 的表达则逆转了这一趋势。这为HuR在肿瘤细胞恶性增殖中的作用提供了依据。此外，Bhattacharyya 等［16］的实验结果表明，miR-122 对CAT-1 mRNA 的抑制伴随着它从细胞质加工体的释放到募集于多核糖体。解除抑制需要使HuR 与CAT-1 mRNA 的3´UTR 竞争性结合。在这里与3´UTR 相互作用的HuR 充当修饰子，从而改变miRNA抑制基因表达的潜力。

1.3 抑制靶mRNA 翻译 HuR 可抑制一小部分编码疾病相关蛋白的靶mRNA 的翻译。HuR 可与p27、胰岛素样生长因子1 受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）和凝血调节蛋白（thrombomodulin，TM）mRNA 的5´UTR 结合并抑制它们的翻译，这种抑制作用被认为是由于这些5´UTR 中的IRES 被破坏所致。人类结肠癌细胞的数据显示，HuR 通过对IRES介导的翻译进行负面干扰来维持结构性降低的caspase-2 蛋白活性水平［17］。而caspase-2 在DNA 损伤诱导的细胞凋亡、细胞周期调控和维持基因组稳定性等方面起着独特的调控作用，因此HuR/caspase-2 轴可能为肿瘤增敏治疗提供一个新的靶点。HuR还被发现与Wnt5a 和c-Myc mRNA 的3´UTR 结合并抑制其翻译。Wnt5a 被抑制的机制尚不清楚，但c-Myc 翻译的减少与HuR 将let-7/RISC 复合物招募到c-Myc 的3´UTR 有关［18］。Mihailovich 等［19］在研究miR-17-19b 在c-Myc 驱动的淋巴瘤中的作用时发现，miR-17/20 下调检查点激酶2（checkpoint kinase 2，CHEK2）导致HuR/RISC 向c-Myc mRNA 募集增加，从而抑制其翻译，最终干扰体内肿瘤的生长。此外，最近有研究表明，环状RNA 多腺苷酸结合核蛋白1（circular RNA polyadenylate-binding nuclear pro⁃tein 1，CircPABPN1）可以与HuR 结合，这种广泛的相互作用抑制了HuR 与PABPN1 mRNA 的结合，从而部分或完全阻断了PABPN1的翻译［20］。

HuR最初被描述为一种稳定性的RBP，后来才逐渐被证明它可以调节靶mRNA 的翻译，通常促进翻译，但有时也会抑制翻译。以上介绍了HuR的部分功能，但实际上其对靶mRNA的功能远不止如此。HuR通过对特定靶mRNA 的转录后影响，参与细胞对应激、分化、增殖、凋亡、衰老、炎症和免疫刺激的反应。

2 HuR功能的调节

由于HuR 参与了许多重要的生物学过程，其功能在多个水平上受到严格的调控，如蛋白质的丰富性和完整性、亚细胞定位和翻译后修饰等。

2.1 HuR 丰度的调节 HuR 蛋白的水平有多种调节方式。关于HuR 表达的转录调控了解得比较少，目前只了解到HuR 的转录受到NF-κB 和Smad 蛋白家族的正调控。相比之下，HuR mRNA 和HuR 蛋白的丰度受到多种调控机制的影响。

2.1.1 HuR 自我调节 与许多甲状腺素视黄质运载蛋白（transthyretin，TTR）-RBP 结合编码自身的mRNA 的能力保持一致，HuR 也能与HuR mRNA 相结合。在HuR mRNA 的不同多聚腺苷酸变体中，HuR 被发现与末端含ARE 序列的长链HuR mRNA结合并使其稳定，这一作用与TTP 促进mRNA 衰变的作用相反。哺乳动物HuR蛋白能通过负反馈环自动调控其表达，通过负反馈环与自身的pre-mRNA 结合，增加含有不稳定ARE 序列的长链mRNA 的表达［21］。HuR 与HuR 3´UTR 的结合也增加了HuR mRNA 的胞质输出。当这种蛋白质的核质分布保持相对恒定或在细胞周期中经历程序性可逆波动时，这种机制可以确保HuR动态平衡［21］。

2.1.2 miRNA调节HuR HuR mRNA通常是miRNA的靶点［22］。Al-Haidari 等［23］的研究表明，miR-155-5p基因敲除降低了结肠癌细胞的趋化性和HuR的胞质表达。进一步研究表明，miR-155-5p 通过与HuR mRNA 3´UTR 处的ARE 位点结合而对结肠癌细胞中HuR mRNA 水平、翻译及迁移起到正向调节的作用，提示靶向miR-155-5p和（或）HuR 可能是有效的抗结肠癌转移的治疗策略。另有研究表明，miR-519 靶向HuR mRNA 并抑制其翻译［24］，从而阐明了RBP 被miRNA 所调控的机制。虽然大多数miRNA 与靶mRNA 的3´UTR 相互作用，但miR-519似乎主要通过与HuR mRNA 的编码区结合而发挥作用。miR-519介导的HuR 丰度降低反过来又降低了一些HuR 靶mRNA 的表达，并显著抑制了细胞增殖。miR-125a也与HuR 3´UTR 相关，同样通过抑制HuR 翻译来抑制HuR 的产生。在乳腺癌细胞中，miR-125a 过表达促进了细胞凋亡，抑制了细胞增殖和迁移［25］。

2.1.3 HuR 泛素化 中度热休克时，HuR 蛋白水平短暂下降。这种减少与HuR 在Lys182 位点的泛素化有关，随后是蛋白酶体介导的蛋白水解［26］。β-TrCP1 是靶向HuR 降解的泛素E3 连接酶［27］。Lan等［28］揭示了OCC-1（一种lncRNA）增强β-TrCP1 与HuR 的结合，使HuR 易于泛素化和降解，从而降低HuR 及其靶mRNA 的水平，包括与癌细胞生长直接相关的mRNA。热休克后HuR 的瞬时降解可通过HuR的磷酸化来拮抗相关的mRNA。

2.2 HuR定位的调节 虽然HuR主要定位于核内，但相较于其在细胞质内的功能，HuR 的核功能除了在pre-mRNA 剪接中的作用有些许了解外，在很大程度上是未知的。HuR 发挥其对mRNA 的功能通常需要从细胞核移位到细胞质［29］。HuR 的铰链区含有一种特殊的穿梭序列，称为HuR 核质穿梭序列（HuR nucleocytoplasmic shuttle sequence，HNS），这使得它能够在细胞核和细胞质之间穿梭。在受到压力（例如低氧应激［30］）时，HuR 会向细胞质转移，来增强特异性mRNA 的稳定性。临床上已经证明HuR 细胞质定位与许多癌症的不良临床预后相关。HuR 穿梭是由关键残基的翻译后修饰控制的，但穿梭激活的确切机制仍有待了解。体外研究表明，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族PKCα 和PKCδ 的磷酸化能调节HuR 的核质穿梭能力［31］。然而，在不同的系统中，HuR 的细胞质转位由p38 MAPK 激活负责。例如，在心室肌细胞中，用苯肾上腺素和血管紧张素II 处理导致HuR 细胞质转位，该转位可被SB203580（p38 MAPK 抑制剂）阻断，但不被白屈菜红碱（PKC抑制剂）影响［32］。

2.3 HuR 的翻译后修饰 HuR 在不同残基上被一些激酶磷酸化，或被辅激活物相关精氨酸甲基转移酶1（coactivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM1）甲基化，影响HuR 的亚细胞定位和（或）它与靶mRNA 的相互作用。有研究表明，PKC 可激活不同HuR 结构域的磷酸化，协调其RNA 与携带ARE 的mRNA 的结合。在人结肠癌细胞中观察到的PKCδ 在Ser318 处的组成型HuR 磷酸化与HuR 同其靶mRNA 的结合增加及随后某些肿瘤相关基因（包括COX-2 和cyclin）的表达在功能上相关［33］。用药物抑制PKC 活性，除了减少Ser318 处的HuR 磷酸化外，还对高细胞质HuR 丰度有很强的抑制作用［18］。因此，高组成性HuR磷酸化可能是在大肠癌、早期腺瘤或炎症性肠病患者组织标本中观察到病理性细胞质HuR水平增加的原因。

3 HuR在HCC发生发展中的作用

肝癌是世界范围内一种常见的恶性肿瘤，每年导致超过70 万人死亡。HCC 是原发性肝癌的主要类型。HCC 的病因与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、肝硬化、酒精中毒和非酒精性脂肪肝等有关。手术切除是HCC 患者的主要治疗手段。然而，由于HCC 侵袭性强并且症状出现较晚，大多数HCC 患者被诊断时，多为癌症晚期，手术治疗效果不佳［34］。由于肿瘤复发和转移的频率很高，HCC 患者的预后仍然很差，5 年生存率低于25%。因此，这些严峻的挑战使得寻找新的HCC诊断生物标志物和有效的治疗靶点变得非常迫切［35］。

在细胞质中，HuR 与数千个靶mRNA 中的ARE结合，其中包括参与多种致癌生物学过程的众多mRNA。HuR与许多编码蛋白质的mRNA结合，这些蛋白质可能参与实现一些肿瘤相关的主要表型：细胞增殖能力增强、细胞存活率增强、局部血管生成增加、逃避免疫识别、促进癌细胞入侵和转移等。在许多类型的肿瘤中普遍观察到细胞质中HuR蛋白水平升高，比如大肠癌、胰腺导管腺癌和非小细胞肺癌［36-37］。在大肠癌中，胞浆中HuR 蛋白的增加与晚期肿瘤分期有关。更重要的是，在裸鼠异种移植模型中，HuR 的过表达促进了结肠癌细胞的生长。Al-Haidari 等［23］的研究首次证明，miRNA 可以直接调控HuR 依赖的结肠癌细胞迁移，并提示靶向miR-155和（或）HuR 可能是抑制结肠癌细胞转移的有效途径。由于HuR 主要在核内，要移位到细胞质中需受其核质穿梭序列和一些蛋白的调控，这对其致癌功能可能是重要的。因此，探究HuR 在HCC 发生发展中的作用可能为找到新的治疗靶点提供策略。

3.1 HuR 稳定靶mRNA 的功能与HCC HuR 的致癌作用主要归因于它与细胞质中与肿瘤相关mRNA的结合和稳定。众所周知，Wnt 通路的异常激活在HCC中很常见。Lai等［38］发现了促进纤维化与肿瘤进展的Wnt-硬脂酰辅酶A 脱饱和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD）-低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）正反馈环，并表明HuR在该循环中的重要作用。在肝星状细胞和肝癌起始干细胞样细胞中，Wnt效应器β-catenin增加了SCD 依赖于甾醇调节元件结合蛋白1的转录，而β-catenin反过来又被SCD产生的单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）稳定。这一循环需要MUFA 抑制RAS 相关核蛋白1与转运蛋白1 的结合，减少HuR 的核输入，提高HuR胞浆水平，进一步增强其稳定LRP5和LRP6 mRNA的能力，从而促进小鼠的肝纤维化和HCC发生。

m6A 修饰涉及多种生物过程，包括肿瘤发生［39］。最近Chen 等［40］在研究Wilms 肿瘤1 相关蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）在HCC 中显著上调并促进HCC 发展的作用机制时，发现WTAP 通过介导m6A 修饰导致了ETS 原癌基因1（ETS proto-on⁃cogene 1，ETS1）的表观沉默，随后证实ETS1在HCC中通过HuR 参与稳定ETS1 mRNA 而使其成为抑癌基因发挥作用，即WTAP 引导的m6A 修饰通过HuRETS1-p21/p27轴促进HCC的进展。

3.2 HuR 促进靶mRNA 翻译的功能与HCC 已有研究表明，自噬是癌细胞的一种生存过程，抑制自噬是肿瘤治疗的策略之一。虽然自噬在HCC中的作用仍不完全清楚，但自噬调节基因的改变，如ATG5、ATG6 和ATG7，会影响HCC 的发展。Ji 等［41］探究了HuR 在自噬小体形成中的调节功能。他们观察到HuR沉默导致肝癌Hep3B 细胞和人胎肝细胞LO2 细胞自噬小体形成和自噬通量的抑制，并确定ATG5、ATG12 和ATG16 mRNA 是HuR 的直接靶点。HuR过表达可能通过促进ATG5、ATG12 和ATG16 mRNA的翻译而参与肝癌细胞自噬的功能障碍。因此，严格控制细胞内的HuR水平对细胞内稳态至关重要。

3.3 HuR 抑制靶mRNA 翻译的功能与HCC 已知葡萄糖代谢重编程是肿瘤的一个标志。为了在低氧环境中有效增殖，癌细胞会迅速地将其能量来源从氧化磷酸化调节为糖酵解［42］。在HCC 细胞中，缺氧可诱导HuR 特异性地结合初级miR-199a 转录本以阻断miR-199a 的成熟（miR-199a 是一种强大的War⁃burg 效应抑制剂），即HuR 将缺氧与Warburg 效应联系起来，从而促进了HCC的发展［43］。

此外，最近研究者也发现了HuR 与肝纤维化和肝硬化的关系［44］，这增加了HCC发生的风险，进一步说明HuR在HCC发生发展中的重要作用。

4 结语

近年来，RBP 已经成为分子生物学研究中的一个新焦点。作为一种RBP，HuR 的生物学功能以及在炎症、肿瘤等病理过程中的作用机制已逐渐被发现，但迄今为止研究者对HuR 在HCC 方面的研究还不够透彻，HuR 对HCC 发生发展和患者预后的影响以及在临床上的应用等，仍是我们未来需要不断探究的问题。