Obscurin及其相关心肌病的研究进展

王远玭、吴炜综述，张抒扬审校

2001年，Young等[1]利用酵母双杂交技术发现了一种与肌联蛋白作用的大分子蛋白，命名为obscurin，自此揭开了obscurin作为横纹肌细胞内第三大骨架分子的重要作用。Obscurin是对OBSCN基因表达的一系列蛋白分子的总称，主要存在于脊椎动物横纹肌组织中。OBSCN基因含119个外显子，通过选择性剪接的方式产生多种转录本，从而得到一个分子量跨度极大的蛋白质族群[2]。Obscurin存在两种大分子同种型，即obscurin-A及obscurin-B，主要分布于人体骨骼肌及心肌细胞中，参与肌节形成及肌浆网结构的维持；近年来也有研究表明，obscurin还参与细胞内钙循环调节及信号转导等[3]。目前发现，OBSCN基因突变可以导致多种心肌病，主要是肥厚型心肌病、扩张型心肌病、左心室致密化不全等[4]。

1 OBSCN基因的发现

伴随着人类基因组计划的完成，人们对新基因的发现和认识出现了爆发式增长。2001年，Young等[1]发现了一种与肌联蛋白相互作用的未知蛋白，以酵母阳性克隆中分离到的一个长750 bp 的互补DNA（cDNA）序列为基础，在已报道的cDNA库中通过双向延长、序列比对，推断出一个全新基因的序列信息及未知蛋白的大致结构，将其命名为obscurin，并初步进行了结构域编码。Russell等[5]分离出长度为600 bp、被认为编码与肌球蛋白轻链激酶（MLCK）相似结构域的人心肌cDNA克隆，发现其实际编码了obscurin C末端的一个结构域，据此成功将OBSCN基因定位于1q42.13。2004年人类基因组计划最终数据发表后，OBSCN基因及obscurin蛋白结构域的命名也经历了一次更新，最终确定了这个大小约190 kb、含119个外显子的巨大基因的序列信息，并推断出obscurin可能的结构域，按顺序重新编号命名[2]。

2 Obscurin的结构及分布

根据OBSCN基因的序列信息及基因序列-蛋白结构关联，可以推断出obscurin为含65个免疫球蛋白样结构域、2个纤连蛋白结构域、能与钙调蛋白结合的IQ结构域和RhoGEF结构域、SH3结构域、DH结构域、PH结构域等的大分子蛋白。OBSCN基因序列中含有多个剪接位点，可以推测该基因表达的蛋白可能存在多种同种型，机体通过选择性剪接的机制来调控[2]。此前人们就发现，obscurin存在两种不同的大分子型，通过选择性剪接得到C末端截然不同的信使RNA；而根据基因中剪接位点的分布，推测可能存在外显子2与77融合而成的小分子型obscurin A（mini A）[2]。这个猜想在后续的研究中得到了验证。Ackermann等[6-7]发现，抗α锚蛋白结合域抗体可使心肌闰盘着色，提示此处可能富集了某种obscurin蛋白亚型，并通过实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹等方法证实了两种全新的小分子型即obscurin-40和obscurin-80的存在。目前NCBI及Ensembl数据库中收录的obscurin蛋白同种型多达十余种，尚不包括少数可疑但尚未被验证的同种型，其分子大小跨度极大（20～950 kDa）[6]。根据分子大小可以将obscurin蛋白同种型分为大分子（720～900 kDa）、中等大小分子（150～500 kDa）及小分子（＜150 kDa）[7]。根据蛋白结构域的特点又可将其分为obscurin-A、obscurin-B及其他小分子型。Obscurin-A和obscurin-B是主要的两种类型，也是目前研究较深入的同种型。二者均属大分子同种型，主要区别在于C端：obscurin-A含GEF/PH结构域，C末端有锚蛋白结合结构域；obscurin-B则不含上述结构域，取而代之的是两个MLCK结构域[2]。

OBSCN基因主要在人体的心肌及骨骼肌组织中表达，在其他组织中几乎不表达，利用RNA印迹法可检测到不同分子量的转录本[5]。表观遗传学研究表明，在胚胎分化为成肌细胞之前，OBSCN基因处于高度甲基化状态，而在成肌纤维过程中发生活跃的去甲基化过程而使基因处于低甲基化状态，细胞通过甲基化-去甲基化作用调控OBSCN基因的时间特异性表达[8]。Ackermann等[6]通过蛋白质免疫印迹及免疫组化的方法，系统性揭示出obscurin可能的同种型及其组织表达差异、细胞内分布差异等信息。该研究团队发现，obscurin在脑、肾、脾、皮肤等组织器官中也有表达，但与骨骼肌、心肌中表达的蛋白亚型不同；其中大分子型obscurin-A及obscurin-B主要存在于骨骼肌、心肌组织中，中小分子亚型则广泛见于多种器官组织；在骨骼肌和心肌细胞中，obscurin主要分布于肌节、肌浆网，在细胞核、毛细血管内皮周围也有某些亚型分布。

3 Obscurin的功能

Obscurin的分子量仅次于肌联蛋白和伴肌动蛋白，三者合称为肌细胞内的三大细胞骨架分子，主要存在于肌节之中[9]。Obscurin-A是肌细胞中的优势同种型，被认为在肌纤维形成、肌浆网发育中起到重要作用，因此又有分子向导之称。而obscurin-B的细胞表达量较低，但在心肌细胞中，存在大量带单个或串联MLCK结构域的obscurin小分子型，它们的作用尚不明确。

Obscurin参与横纹肌纤维形成。在肌纤维横纹化的过程中，obscurin在细胞内的定位发生动态变化。胚胎发育过程中，成肌细胞内最早形成的是线性连续性的肌动蛋白丝，辅肌动蛋白也呈线性分布。此时，肌细胞中几乎检测不到obscurin。随后，肌联蛋白与obscurin几乎同时或先后组装上去，肌联蛋白与肌动蛋白丝延伸方向平行，跨越整个肌节，而obscurin与肌动蛋白丝垂直，主要集中于M线及新生肌节的Z盘水平。Obscurin出现后，辅肌动蛋白的分布也随之发生变化，呈横纹状集中分布于Z盘水平[10-11]。Obscurin在A带M线表达后，引导肌球蛋白组装至A带。利用病毒转染使早期肌细胞过表达obscurin的C端，可导致A带中的肌球蛋白量明显减少，而肌间蛋白不受明显影响[12]。通过利用病毒转染小干扰RNA靶向干扰obscurin的第一个编码外显子，从而降低obscurin表达量，有研究者发现，虽然辅肌动蛋白仍能实现横纹化分布，但肌纤维更容易出现分叉、零散、多分支现象，肌球蛋白弥漫分布，肌细胞无法有效收缩[13]。与此同时，obscurin与肌浆网特异的锚蛋白（Ank 1.5） 作用，引导肌浆网在Z盘水平的集中分布及肌节间纵向延伸。特异性敲除OBSCN基因的纯合子小鼠心肌组织电镜切片后，发现其纵向延伸至M线的肌浆网显著减少[14]。

2017年，有报道提出，obscurin与肌细胞内钙循环的建立密切相关，并首次发现了obscurin突变与心肌细胞电活动异常的相关性[15]。OBSCN基因R4344Q突变在一肥厚型心肌病家系中被证明有致病性[16]。在特异性敲入该位点突变的纯合子小鼠模型中观察到，静息状态下1岁的小鼠心肌大体结构无明显变化，但心电监护显示突变小鼠的基础心率更快，更容易出现自发室性心律失常。对钙循环相关蛋白的检测提示，肌浆网钙泵2a表达量升高，而受磷蛋白（PLN）五聚体明显下降，肌浆网内钙储量增加，从而引起钙电流的不稳定；其作用机制可能与突变结构域Ig58与PLN作用增强有关；在长期不稳定钙电流刺激下，心室出现重构，继发心肌肥厚或心室扩大[15]。

此外，obscurin-A含有的RhoGEF结构域被认为参与Ras同源基因家族成员A（RhoA）-Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶1（ROCK1）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CRIK）信号通路的调控，从而介导心肌肥厚[17]。Obscurin将Ank 1.5聚集于M线水平抑制钾离子通道四聚化结构域-6蛋白（KCTD6）介导的锚蛋白降解[18]。体外动物实验发现，位于心肌细胞闰盘中的obscurin小分子型过表达可引起心肌细胞连接松散、细胞体积缩小，可能与小分子型通过PH结构域与细胞膜上的磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸（PIP2）结合，调节磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的激活相关[7]。更多的obscurin分子型功能尚待进一步研究。

4 OBSCN基因突变及相关心肌病

目前明确，与OBSCN基因突变相关的疾病主要为遗传性心肌病、肌病等。2007年，一名日本青年被发现携带R4344Q杂合突变并表现为肥厚型心肌病[16]。有研究人员利用全外显子组测序技术，在74例中国散发性肥厚型心肌病患者中鉴定出6个全新的罕见OBSCN基因变异，均为杂合子致病，其中4个为靠近N端的移码突变，2个为靠近C端的点突变，而在2 000例正常对照者中不存在上述变异，因此这些基因变异高度可疑致病，但具体致病机制尚不明确[19]。在一项对30例扩张型心肌病终末期患者心肌样本进行全外显子组测序的研究中，4个样本检测出OBSCN基因突变，其中3个考虑为可疑的致病突变，导致obscurin表达量明显下降（为对照组的45%～72%），而正常对照、非OBSCN基因突变的扩张型心肌病及肥厚型心肌病患者之间的obscurin表达量无明显差异，提示OBSCN基因突变可能通过单倍体不足的机制致病[20]。在左心室致密化不全、远端肌萎缩等疾病中，也有少数OBSCN基因突变的报道。Rowland等[21]在10例左心室致密化不全患者中检测到3个全新的OBSCN基因突变，包含2个移码突变和1个剪接突变，突变位点均集中于obscurin-B特有的C末端。在一个法国家系中，同时携带OBSCN c. 13330C＞T和FLNC c.5161delG突变的患者表现为远端肌萎缩，较此前保加利亚家系中报道过的FLNC c. 5160delC致病的外显率更高，发病年龄更早，检测发现患者体内的突变型obscurin与肌联蛋白的结合力下降约15倍，可能通过降低肌纤维的稳定性而促进远端肌萎缩的发病[22]。Forleo等[23]利用靶基因测序技术，在8例致心律失常性右心室心肌病患者中，检测出其中2例有3个OBSCN基因变异，其中OBSCN c. 17371G＞C为可疑的致病突变，但缺乏进一步的功能验证研究。此外，有临床研究表明，携带OBSCN基因突变的乳腺癌患者在接受化疗或靶向治疗过程中更容易出现左心室射血分数下降甚至扩张型心肌病[24]，提示OBSCN基因的多态性在肿瘤心脏病学研究中亦是不可忽视的一部分。化疗相关的心脏毒性生物标志物，包括一些应用转录组学或代谢组学检测到的标记分子，作为早期识别和诊断化疗期间心脏毒性的重要手段，正逐渐被临床认可和重视[25]。如果能从基因水平识别出化疗相关心脏毒性的高危人群，就能预先针对性地调整化疗方案和采取预防措施，达到精准医疗的目的。

5 小结

综上所述，obscurin在心肌的发育及正常结构功能的维持中发挥着重要的作用。关于obscurin的功能，仍有许多尚未明确的机制值得进一步深入研究，包括其不同分子型的表达调控及功能差异、对肌细胞电活动及细胞间连接稳定性的影响等。随着测序技术的发展，发现许多不明原因的心肌病患者中存在多种多样的OBSCN基因变异，但大多缺乏有关其致病性及致病机制的深入研究。基因检测对于遗传性心肌病的早期诊断、治疗和预后的意义日益显著，在探索疾病发病机制、危险分层和指导优生优育方面有不可替代的作用[26]，而由于OBSCN基因序列长，功能区复杂，可能存在许多并不具有致病性的单核苷酸多态性，需要进一步研究，以明确OBSCN基因变异与心肌病发生、发展的关系，探究其可能的致病机制，寻找药物治疗、基因治疗的靶点等。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突