去泛素化酶在肝癌发生发展中的研究进展*

贾雪冰 李琦

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别位居第6 位和第3位［1-2］。在分子机制方面，肝癌进展相关基因的作用往往取决于其蛋白产物水平及翻译后修饰，如泛素化、磷酸化和乙酰化等。因此，探索这些基因在蛋白水平上的调控机制对于肝癌的分子靶向治疗具有重要的理论价值。

泛素蛋白酶体途径是由调节蛋白质稳定和降解的泛素化和去泛素化组成的高度动态过程。去泛素化酶参与去泛素化的机制错综复杂，不仅能解除泛素化，而且可以通过再循环泛素分子、校对泛素化进程、分解泛素化抑制因子等方式促进泛素化过程［3］，其异常活动可能与癌症的发生发展密切相关。近年来，有关去泛素化酶与肝癌发生机制有一些新的研究。本文将对在肝癌中发挥作用的去泛素化酶及去泛素化酶抑制剂的研究新进展进行综述。

1 去泛素化酶家族及其作用

1.1 去泛素化酶家族的组成

目前，已发现的去泛素化酶约有99种，根据去泛素化酶活性部位不同可以将其分为7大家族，分别是泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases，USPs）、泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、卵巢肿瘤相关蛋白酶家族（ovarian tumor-related proteases，OTUs）、MJD 结构域蛋白酶家族（Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs/Josephins）、含JAB1/PAB1/MPN 结构域的金属蛋白酶家族（JAB1/PAB1/MPN domain-containing metallo-enzymes，JAMMs）和单核细胞趋化蛋白诱导的蛋白酶家族（mococyte chemotactic proteininduced protein，MCPIPs）以及最近发现的锌指含泛素肽 酶1（zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUP1）。7个家族中除了JAMMs（也称为MPN）家族，其他6 个被归类为半胱氨酸蛋白酶，而JAMMs 家族由锌依赖金属蛋白酶组成。USP 家族是目前已知去泛素化酶家族中成员最多、结构最具多样性的一类。除了MJDs，每个家族的基因在酵母和人类中都是高度保守的。在去泛素化酶的99 个家族成员中，有11个由于失去了去泛素化活性的关键残基而被认为是假酶，但它们仍然可以通过变构激活具有催化活性的去泛素化酶和其它活性酶而发挥重要的生物学作用［4］。

1.2 去泛素化酶的功能

泛素化和去泛素化之间的平衡与蛋白质水平和活性的调控密切相关。去泛素化酶是作用于泛素分子之间或泛素与被修饰蛋白质之间的肽或异肽键的蛋白酶。去泛素化酶以两种完全不同的方式处理泛素修饰：1）通过不同催化域的蛋白质相互作用而定向于特定的蛋白质底物［5］；2）识别和选择特定的泛素链结构［6］。去泛素化酶具有以下功能：1）维持游离泛素水平，即将泛素分子从泛素化的蛋白底物上游离出来；2）从任何泛素介导的降解途径（蛋白酶体、内泌体和自噬体）中解离蛋白质，防止其降解；3）控制泛素介导的后续生理活动的启动［5］。去泛素化酶通过逆转蛋白质泛素化降解过程，进而调节蛋白质相互作用、定位和酶活性，影响细胞过程，包括转录、DNA 损伤信号和DNA 修复、细胞周期进展、内吞作用、细胞凋亡等［7］。随着研究的深入，研究者们发现抑制去泛素化酶活性可能成为一种新的肿瘤治疗方法，如可以调节各种癌基因或肿瘤抑制基因蛋白水平或活性的USP7 和USP28 等，以及与促进肿瘤生长的关键表观遗传变化有关的USP22等［8］。由此可见，DUBs可能成为肿瘤潜在的治疗靶点。

2 去泛素化酶在肝癌发生发展中的作用

目前，有关去泛素化在肝癌中作用的研究不多，仅涉及USPs 家族（包括属于USPs 亚家族的CYLD）。其中，研究较多的有USP22、USP7 和CYLD 等。USP的结构域高度保守，包括3 个亚结构域：Finger、Thumb 和Palm［9］，大多数USP 蛋白含有1 个催化区域和与其它蛋白相互作用的结构域。CYLD缺乏Finger亚结构域，它是一个与肿瘤综合征相关的去泛素化酶。泛素的C-端插入到USP 介于Thumb 和Palm 亚结构域之中，而泛素的球状部分则与Finger亚结构域相互作用。USP 家族的成员通过调控靶基因的表达而对肝癌细胞的生长、增殖、分化及凋亡起重要作用。

2.1 USP22在肝癌中的作用

泛素特异性蛋白酶22（USP22）主要通过去泛素化修饰调节细胞内的生化反应，在肿瘤发生、耐药和细胞周期等方面发挥作用。USP22 与肿瘤发生发展的机制主要与BMI-1、MYC、TRF1 等因子有关，这一特点使其可能成为肿瘤干细胞标志物之一。

2.1.1 USP22促进肝癌干细胞生成 在缺氧条件下，USP22 和TP53 作 为HIF1α 的直接靶基因可以被HIF1α 转录上调。在TP53 野生型肝细胞癌中，TP53能抑制HIF1α诱导的USP22上调，而HIF1α可以通过转录上调TP53 进而促进其抑制作用。在TP53 突变的肝癌细胞中，USP22和HIF1α形成一个正反馈回路并促进肝癌细胞的干性。TP53突变且USP22和（或）HIF1α高表达的肝细胞癌患者往往预后较差。同时，靶向USP22 的脂蛋白复合物能抑制小鼠肝脏肿瘤的发生并增强索拉非尼的敏感性［10］。综上，USP22通过TP53失活后的HIF1α/USP22正反馈回路促进缺氧诱导的肝癌干细胞生成。因此，USP22有可能成为肝细胞癌的治疗靶标。

2.1.2 USP22增强抗肿瘤免疫 PD-1（CD279）-PDL1（CD274）抑制信号转导对癌症免疫逃避至关重要，已成为抗肿瘤免疫治疗的主要靶点之一。USP22 可直接与CD274的C端相互作用，诱导其去泛素化和稳定。USP22 在肝癌中高表达与患者的不良预后密切相关。USP22基因缺失能抑制小鼠肝癌生长，增加肿瘤免疫原性和肿瘤浸润淋巴细胞，提高CD274 靶向免疫治疗和顺铂化疗的疗效［11］。因此，靶向USP22是增强CD274抗肿瘤免疫的有希望的策略。

2.1.3 USP22 在肝癌耐药方面发挥作用 肝细胞癌的药物治疗常因多药耐药（MDR）而失败，USP22表达水平是BEL7402 和BEL/FU 细胞耐药表型改变的原因。USP22下调显著抑制ABCC1（编码多药耐药相关蛋白MRP1）的表达，USP22 可以通过激活SIRT1/AKT/MRP1通路促进肝癌细胞中MDR的表达［12］。因此，USP22 可能是一个逆转肝癌多药耐药的潜在靶点。通过干扰核糖核酸下调耐药肝癌细胞系中USP22 的表达可导致耐药基因BMI1 的表达下降，相应地，USP22高表达可通过上调BMI1的表达，在肝癌患者化疗药物耐药中发挥重要作用［13］。因此，USP22和BMI1 的共表达可能成为肝癌预后的新指标，有助于指导临床治疗。USP22 基因被敲低后，通过下调PI3K 和激活Smad4 来发挥其功能，而Smad4 可以抑制Akt 的磷酸化。同样，沉默Smad4 可阻断敲除USP22 后诱导的Bel/Fu 细胞中Akt 的抑制，进而抑制细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化，抑制体内的致瘤和转移能力和耐药相关蛋白（MDR1、LRP、MRP1）等［14］。

2.1.4 USP22 在肝癌进展中的作用 肝癌组织中USP22和Survivin的表达与肿瘤的大小、分期、分化等恶性行为密切相关。敲低USP22 基因可下调Survivin、Cyclin B的表达、上调p21的表达，这提示USP22 与Survivin 的协同作用参与HCC 的进展［15］。USP22高表达提示患者预后较差，总生存率和无复发生存率较低。USP22 可作为肝癌独立的预后分子标志物［16］。其中关于USP22的研究相对较多，它在肝癌的耐药、免疫及癌症进展中发挥着重要作用，且USP22的特异性抑制剂LY294002已被证明可以抑制癌症进展，但目前鲜见相关临床试验开展。

2.2 USP7在肝癌中的作用

USP7通过去泛素化稳定甲状腺激素受体相互作用蛋白12（TRIP12），使p14（ARF）失活，促进肝癌的进展。与正常肝组织相比，肝癌组织中USP7的RNA和蛋白表达水平均有上调，USP7 高表达与肝癌患者的恶性表型显著相关，包括分期较晚、肿瘤体积大、肿瘤多灶性、分化差、甲胎蛋白升高、微血管侵犯等。此外，USP7和（或）TRIP12高表达的肝癌患者总生存期短、肿瘤复发率高［17］。除了TRIP12，Hippo 通路的关键分子YAP是USP7调控肝癌的另一个靶点，USP7通过稳定YAP促进肝癌细胞的增殖［18］。脂肪细胞分泌的外泌体环状RNA 通过抑制miR-34a，激活USP7/Cyclin A2 信号通路，促进肿瘤生长，减少DNA损伤［19］。总之，USP7 可增强HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的进展。因此，USP7可作为肝癌患者预后的标志物，也是肝癌潜在的治疗靶点。

2.3 CYLD在肝癌中的作用

临床上，许多肝癌患者常有罹患肝病的病史，如慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等。因此，去泛素化酶与这一动态过程的关系不可忽视，如去泛素化酶CYLD 在肝脏脂肪变性和炎症发生过程中起重要保护作用，可防止其进一步发展为肝硬化，甚至肝癌。在肝脏损伤后，CYLD有助于肝脏内环境的稳定和恢复，CYLD活性的突变或中断可加重急性和慢性肝损伤，进而促进肝癌的发生和发展［20］。CYLD在肝细胞中的失活会导致细胞凋亡、炎症、纤维化和肿瘤发生。肝脏特异性CYLD通过自发的慢性激活TGF-β活化激酶1（TAK1）和C-Jun N端激酶（JNK）而阻止肝细胞程序性死亡，引起肝星状细胞和库普弗细胞活化，从而促进肝细胞的纤维化、炎症、肿瘤坏死因子的产生，以及肝细胞凋亡向中央静脉的扩张，后期代偿性增殖导致癌灶形成［21］。也就是说，去泛素酶CYLD 在肝细胞中的失活会导致肿瘤发生。在肝癌细胞系中过表达野生型CYLD可抑制细胞增殖，但不影响细胞凋亡、黏附和迁移。Pannem 等［22］通过对81例人肝癌组织的免疫组织化学和组织芯片分析发现，CYLD的表达与增殖标志物Ki-67和c-MYC的表达呈负相关，即CYLD 的下调可诱导肿瘤细胞增殖，促进肝癌的侵袭性生长。因此，CYLD可作为肝癌进展的潜在标志物。

2.4 其他去泛素化酶在肝癌中的作用

USP9 可以被XLNC473 募集来抑制Survivin 的泛素化水平，增加Survivin 的表达，增强肝癌细胞的增殖和侵袭，并诱导上皮-间质转化（EMT）过程［23］，这与USP22 有着相似的功能。USP39 表达下调将细胞周期阻滞在G2/M 期，从而抑制肝癌细胞的生长［24］。因此，上调USP39 表达能促进肝癌细胞增殖［25］。USP4/CypA复合物通过去泛素化作用抑制CypA在肝癌细胞中的降解，激活MAPK信号通路，阻止CrkII磷酸化，促进肝癌细胞的生长、迁移和侵袭［26］。另外，USP4 通过去泛素化其下游靶分子TAK1，进而抑制TAK1激酶活性及下游NF-κB和JNK等通路活性，从而有效改善肝脏细胞脂肪堆积，防止肝代谢紊乱的进一步发展［27］。USP11 可以促进HCC 细胞的迁移和侵袭，且与血管侵犯（P=0.033）、分化（P=0.027）、肿瘤数目（P=0.009）、复发（P=0.036）和较短的总生存时间（P=0.001）有关［28］。其他泛素酶成员如USP5、USP18、USP27、USP30、USP14 等，都是通过作用于其下游靶基因表达而促进肿瘤发生发展［29-32］。USP10 在肝癌中发挥抑癌作用，其通过稳定AMPKα 和PTEN 进而抑制mTORC1激活，这为临床上以mTOR信号通路为导向的靶向治疗奠定了理论基础［33］。在化学诱导的小鼠肝癌模型中，缺乏USP28 的小鼠更容易形成肿瘤，提示USP28 参与肝癌的抑制，并有可能成为肝癌的预后标志物［34］。

3 去泛素化酶抑制剂在肝癌中的研究进展

去泛素化酶抑制因子WP1130 联合阿霉素治疗肝癌，其机制在于通过促进P53的泛素化降解来抑制阿霉素介导的p53 上调［35］，即WP1130 可以提高阿霉素的化疗敏感性，这对于指导临床化疗的联合用药有重要意义。USP7抑制剂P22077可以抑制Huh7和SK-Hep1 等肝癌细胞的增殖和迁移，并且在肝癌的异种移植模型中有效的抑制了肿瘤的生长［18，36］。BAP15是泛素特异性肽酶14（USP14）的强效选择性抑制剂，能显著降低肝癌细胞活力，增加细胞凋亡，并干扰细胞周期，降低细胞周期相关蛋白的表达。此外，这种抑制作用呈剂量依赖性。同时，B-AP15 通过增强内质网应激/UPR和抑制Wnt/Notch1信号通路来诱导肝癌细胞的细胞毒性反应［37］。这一新发现为B-AP15抗肿瘤治疗作用提供了新的机制。USP22通过激活SIRT1/AKT/MRP1 通路促进肝癌细胞中的MDR，而USP22 的特异性抑制剂LY294002 可以通过对AKT通路的抑制导致MRP1的下调，从而抑制癌症进展［12］。蛋白酶体相关的去泛素化酶抑制剂金诺芬（auranofin）可以联合乙醛脱氢酶抑制剂双硫仑（disulfiram）协同诱导肝癌癌细胞的凋亡［38］，可作为潜在的新型抗癌策略。另外，PR619作为一种非特异性的去泛素化酶抑制剂，可以作用于多种去泛素化酶。这些都为寻找肝癌新的药物治疗靶点提供了理论依据。

4 总结与展望

晚期肝癌的化疗，如FOLFOX方案取得了一定疗效，可以延长患者生存至6.5个月。靶向药物索拉非尼、瑞格非尼、仑伐替尼等相继获批用于肝癌治疗，但总体有效率较低。虽然免疫检查点PD-1 抑制剂等逐步用于肝癌的治疗中，但总体效果不令人满意。因此，积极探索肝癌发生的分子机制对于研发新的肝癌靶向药物具有重要的临床意义。泛素化以及去泛素化作为调控细胞内蛋白质水平和活性的重要步骤，在肝癌的发生发展中发挥重要作用。目前关于去泛素化酶在肝癌中作用的研究较少，仅有14个USP 家族（包括USP 亚家族的CYLD）的去泛素化分子被报道。其中有关USP22 的研究相对较多，且USP22的特异性抑制剂LY294002已被证明可以抑制癌症进展，但尚未开展相关临床试验，对去泛素化酶及其抑制剂作用有待全面深入的了解，为肝癌的靶向治疗提供参考依据。