mTOR信号通路在特发性肺纤维化中的作用研究进展

马 玲，魏玉丽，黄 凯，周红刚，杨 诚

（1.南开大学药学院，天津 300350；2.天津国际生物医药联合研究院高通量分子药物筛选中心，天津 300457）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种原因不明的进行性间充质性肺疾病，组织学和影像学表现为寻常型间充质性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）［1-2］。IPF 患者的肺组织被细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白填充使其实质化，致使肺泡结构被破坏，肺顺应性降低，气体交换受阻，最终导致呼吸衰竭和死亡［3］。IPF在男性较为常见，在<50岁的人群中很少见（诊断的中位年龄约为65岁）。IPF发病率与胃癌、脑癌和睾丸癌相似，IPF患者确诊后中位生存期为2～4年［4］。在欧洲和北美，IPF 发病率为每年 2.8～18.0/10万人，且随环境污染的加重，其发病率在全球都有所上升［5］。在生理条件下，纤维化的发生是响应组织损伤而启动的，通常由上皮损伤引起，从而导致凝血和炎症级联反应的激活，进而导致专司释放ECM成分的成纤维细胞的活化、募集和增殖［6］。在IPF的纤维化过程中，伤口修复的任何阶段都可能失调，从而导致瘢痕组织不可逆地积聚。

哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白〔mam⁃malian target of sirolimus（Rapamycin），mTOR〕是西罗莫司的机制靶标，mTOR信号通路在感知环境条件、调节细胞和机体功能中具有重要作用。mTOR属于磷酸肌醇3-激酶类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可与体内其他蛋白质形成2种复合物，称为mTOR 复合物 1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTORC2。mTORC1由3个核心成分mTOR，Raptor和mLST8（也称为GßL）及2个抑制性亚基PRAS40和DEPTOR组成。mTORC2包含mTOR和mLST8、Rictor、DEPTOR及调节亚基结合伴侣哺乳动物应激激活蛋白激酶相互作用蛋白1（mammalian stressactivated protein kinase-interacting protein 1，mSin1）和Protor1/2［7］。mTORC1通过磷酸肌醇3-激酶类信号通路接受细胞内外生长因子、细胞应激、营养物质和能量变化等多种因素的影响，进而作用于下游的2个主要底物，即核糖体蛋白S6激酶（S6K）和真核生物翻译起始因子4E结合蛋白1（eIF4E-binding protein 1，4E-BP1），从而调节蛋白质的合成，调控细胞的生长、增殖和自噬等［8］。mTORC2主要通过调节蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的活性调控骨架蛋白的合成、细胞的存活以及代谢［9］。

异常的mTOR信号通路参与很多纤维化疾病，如心、肝和肾纤维化［10-12］。越来越多的数据表明，mTOR信号通路在肺纤维化中具有重要作用。通过阅读mTOR信号通路在IPF中作用的文献，综述相关药物临床用药及作用机制，为今后研究提供文献支持。

1 mTOR与IPF的关系

IPF患者肺中mTOR的表达与纤维化评分和肺功能下降密切相关，提示其可能与肺纤维化的预后有关［13］。在平阳霉素（博来霉素）诱导的小鼠肺纤维化模型中存在mTOR的过度活化，并参与了肺纤维化形成过程［14］。并且平阳霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中肺组织内PI3K，p-Akt和p-mTOR的蛋白表达水平与正常对照组比较也明显升高［15］。慢病毒介导的mTOR-小干扰RNA（siRNA）可有效抑制大鼠百草枯中毒肺组织中mTOR表达，减轻百草枯致肺组织损伤和纤维化程度［16］。mTOR信号通路还参与高氧肺损伤纤维化修复过程，西罗莫司（雷帕霉素）及mTOR-siRNA均可抑制mTOR信号通路，保护早产大鼠高氧导致的肺损伤，且对肺纤维化有一定的抑制作用［17］。

以上研究表明，在IPF模型和疾病进展中mTOR信号异常活化，活化的mTOR信号通路参与了纤维化病变。以下从肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AEC）、成纤维细胞、上皮间充质转化和致纤维化因子释放方面简述mTOR信号通路在IPF中的作用。

1.1 mTOR在肺上皮细胞中的作用

肺泡上皮细胞是肺部抵御环境侵害和感染的第一道屏障［18］。组成肺泡的上皮细胞主要有2种：①Ⅰ型肺泡上皮细胞（alveolar typeⅠepithelial cells，ATⅠ）由于其扁平化的表型较大，覆盖了90%的气道表面，其主要功能是气体交换［19］；②ATⅡ主要功能是产生表面活性剂，降低肺泡内的表面张力来实现气体交换［20］。IPF患者肺部表现出典型的肺泡上皮完整性丧失、基底膜完整性破坏和肺泡结构塌陷［21］。一旦上皮受到损伤，伤口愈合的上皮/成纤维细胞途径就被激活，对上皮的持续损伤和伴随的细胞凋亡促使纤维化瘢痕的延续［22］。

1.1.1 肺上皮细胞自噬

自噬是一种进化保守、遗传程序化的细胞内降解途径，是真核细胞内一种重要的细胞稳态机制。自噬调节细胞生长、代谢和存活，在维持细胞内环境平衡中起着重要作用。自噬缺陷广泛存在于ECM富集、肺上皮细胞功能障碍、凋亡、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号刺激和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）系统等促进肺纤维发生发展过程［23］。IPF的病理机制最关键的环节就是肺组织稳态受损及肺组织的异常修复，维持肺组织细胞稳态、阻断肺组织异常修复可能成为攻克IPF的关键之一。细胞自噬正是维持细胞稳态的重要途径，并且mTOR信号通路在自噬中起核心调控作用。

在IPF大鼠模型中，PI3K/Akt/mTOR在ATⅡ高表达，抑制细胞自噬，促进胶原蛋白合成，促进IPF发生［24］。在条件性和诱导性结节性硬化复合症（tuberous sclerosis complex，TSC）致病基因Tsc1敲低SPC-rtTA/TetO-Cre/Tsc1（fx/+）（STT）小鼠中，肺泡上皮细胞中mTOR过表达。平阳霉素引起Tsc1STT小鼠肺组织肺泡上皮细胞中的mTOR激活，自噬体减少；西罗莫司诱导自噬体产生并降低P62表达［25］。以上结果表明，肺泡上皮细胞中mTOR过度活化和肺部自噬受损与肺纤维化的发病机制有关，mTOR的抑制和增强自噬可用于治疗肺纤维化。

1.1.2 肺上皮细胞炎症

在肺部受损后，受损的肺泡上皮细胞释放出各种趋化因子，将趋化性单核细胞和中性粒细胞募集到损伤部位。在IPF中反复的细胞损伤，中性粒细胞和巨噬细胞不能被足够快地消除，它们可连续产生活性氧而进一步加剧纤维化级联反应。中性粒细胞募集到支气管肺泡腔被认为是IPF患者早期死亡的预测指标，巨噬细胞和中性粒细胞在肺纤维化小鼠模型中均被确定为促纤维化细胞类型［26-27］。

在正常肺组织中，Smad信号转导可刺激成纤维细胞增殖和胶原蛋白沉积，从而形成低氧环境，进一步激活mTOR信号转导，从而促进成纤维细胞存活和纤维化进展［28］。TGF-β介导的Akt信号可进一步激活mTOR信号转导，调节单核细胞和巨噬细胞等炎症细胞的炎症反应［29］。肺泡上皮钠通道（epithelial sodium channel，ENaC）是清除肺泡水肿液的重要环节。研究发现，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路能正向调节ENaC，抑制mTOR活性能阻断受刺激后肺泡上皮Na+-K+-ATP泵的上调，清除肺内多余的水肿液，从而减轻肺组织损伤［30］。中华冬虫夏草菌丝体（Hirsutella sinensismycelium，HSM）通过抑制mTOR以及下游P70S6K的活化，显著降低肺泡巨噬细胞的趋化性，并有效抑制炎症细胞因子的表达，抑制平阳霉素诱导的肺纤维化［31］。

1.1.3 肺上皮细胞凋亡

细胞黏附或黏附信号的丧失可能导致一种称为“失巢凋亡”的细胞凋亡。“失巢凋亡”很可能代表结构细胞（包括上皮细胞和间充质细胞）中重要的凋亡机制，这些细胞通常黏附于基础基底膜或其他ECM蛋白［32］。越来越多的证据支持在IPF中肺泡上皮细胞呈现凋亡易感性和成肌纤维细胞的凋亡抗性。

在IPF中，氧化应激持续存在，通过TGF-β活化的成纤维细胞也产生大量的过氧化氢，诱导上皮细胞凋亡［33］。肺成纤维细胞也是肺泡上皮细胞凋亡、剥脱和上皮再生延迟的一个因素［34］。在TGF-β诱导的IPF肺成纤维细胞中，抑制mTOR的活化可保护AEC免受成纤维细胞造成的损伤［35］。在小鼠肺上皮细胞MLE-12中，微RNA（microRNA，miR）-142-3p过表达可能通过调节COX-2表达和PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制平阳霉素诱导的凋亡和炎症［36］。

1.2 mTOR对肺成纤维细胞的影响

在正常情况下，成纤维细胞很少或没有肌动蛋白相关的细胞-细胞和细胞-基质接触，几无ECM产生。组织损伤后，成纤维细胞被活化，分化为收缩性和分泌性肌成纤维细胞，并迁移到受损组织中［37］。在受损组织局部释放的细胞因子作用下，肌成纤维细胞合成ECM成分对损伤部位进行修复，但当ECM蛋白分泌过多时，它们会降低肺组织顺应性严重损害器官功能［38］。肌成纤维细胞在促进ECM沉积，炎症介质释放和上皮损伤中起重要作用，是使损伤和纤维化循环永存的关键因素［39］。

1.2.1 肺成纤维细胞自噬

IPF成纤维细胞灶内肌成纤维细胞p-mTOR表达增强，且自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达降低，表明其肺成纤维细胞中存在明显的自噬不足［40］。在TGF-β1诱导的原发性人肺成纤维细胞中，p-mTOR、胶原和纤连蛋白水平表达明显升高；西罗莫司处理后，这些蛋白水平受到抑制，p-P70S6K表达增加。表明西罗莫司通过mTOR/P70S6K途径诱导自噬，抑制TGF-β1诱导的胶原和纤连蛋白表达［41］。中药益肺散结方也是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增强自噬对小鼠肺纤维化起到抗纤维化作用［42］。所以，抑制成纤维细胞中mTOR通路诱导自噬的发生，可有效缓解肺纤维化。

1.2.2 肺成纤维细胞的活化和细胞外基质的表达

肺成纤维细胞的增殖和分化是ECM产生的前提，抑制成纤维细胞的活化，可有效抑制ECM成分的沉积。研究表明，对西罗莫司不敏感的mTORC1/4E-BP1信号转导是人肺成纤维细胞中TGF-β刺激的胶原合成的关键途径之一［43］。HSM减轻了平阳霉素治疗的小鼠成纤维细胞灶中mTOR的过度活化，从而抑制了成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化过程［31］。新型mTOR抑制剂P529抑制人肺成纤维细胞中TGF-β诱导的mTOR信号转导，抑制成纤维细胞分化和TGF-β诱导的ECM沉积［44］。

研究发现，mTORC2在肺纤维化的发病机制中也起到一定作用。在TGF-β诱导的IPF肺成纤维细胞中mTORC2的成分Rictor表达升高，导致Akt激活，从而促进纤维化基质调节蛋白的表达。并且MLN0128（mTOR复合物抑制剂）抑制了TGF-β刺激的IPF成纤维细胞活化。间充质细胞中mTORC2的作用还与mSin1相关。在肺纤维化进程中，JNK1的过表达诱导了mSin1的表达，并可驱动非纤维化间充质细胞中的mTORC2和mTORC1活化以及Ⅰ型胶原的表达，这种作用可被siRNA介导的mSin1沉默所逆转［45］。在IPF发展过程中，由PARK2缺乏引起的线粒体不足诱导了线粒体活性氧的产生，同时伴随着PDGFR/mTOR信号转导，导致成肌纤维细胞分化和增殖增加［46］。以上研究证明，mTOR信号转导可从多种途径诱导成纤维细胞的活化，抑制mTOR信号或可抑制成纤维细胞的活化。

1.2.3 肺成纤维细胞凋亡

在肺纤维化中，mTOR信号通路参与了肌成纤维细胞的凋亡调控。异常的PTEN/Akt/mTOR通路抑制自噬，使IPF成纤维细胞从聚合的胶原蛋白驱动的应激中脱敏从而产生抗凋亡表型，使IPF成纤维细胞在胶原蛋白上保持活力［40］。长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）能调节相邻基因，蛋白编码基因核糖体蛋白S6激酶B-2（ribosomal protein S6 kinase β2，RPS6KB2）为lncRNA AP003419.16相邻的基因。学者认为，RPS6KB2参与了衰老和IPF过程，并且RPS6KB2的激活受到蛋白激酶mTOR信号通路的调节。研究表明，IPF患者AP003419.16的表达显著增加，而RPS6KB2同时增加，表明衰老与IPF相关［47］。进一步研究表明，mTORC1激活减少衰老和IPF中的自噬，且该途径的激活还有助于抵抗IPF成纤维细胞死亡［48］。

1.3 上皮间充质转换

在病理学上，IPF的特征是纤维化灶，其中肌成纤维细胞和活化的成纤维细胞是主要的效应细胞，有观点认为这些间充质细胞通过上皮间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）从上皮细胞发育而来［49］。这虽不太可能成立，但在IPF患者肺组织样本中，AEC的形态高度异常，形态和表型标志物表达发生改变，其主要的特征有细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白）表达减少、纤连蛋白表达上调等［50］。在癌症的进展和转移中，经历EMT的细胞中mTORC2被诱导活化，并且该过程似乎在肿瘤上皮细胞的转化的过程中具有一定的控制作用［51］。研究表明，西罗莫司能逆转某些细胞中的EMT，且完全阻断PI3K/Akt/mTOR作用后，EMT进程也被破坏［52］。

实验表明，在TGF-β诱导A459细胞中，西罗莫司可抑制上皮细胞的EMT进程，进而延缓肺纤维化进程［53］。研究发现，miR-503可通过抑制PI3K/Akt/mTOR/Snail信号途径介导EMT过程，从而缓解二氧化硅诱导的肺纤维化［54］。西罗莫司抑制平阳霉素诱导的小鼠肺组织中的E-钙黏蛋白的下调和纤连蛋白的上调，此外，西罗莫司预处理还可降低平阳霉素诱导的小鼠肺组织中接受EMT的肺泡上皮细胞的比例［55］。抑制mTOR信号通路的活化能有效抑制EMT的发生，从而缓解肺纤维化。

1.4 肺致纤维化因子的释放

在肺部损伤初期，在损伤部位AEC会分泌血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、TGF-β1和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）等促纤维化因子，促使肺成纤维细胞的活化和肺泡上皮细胞转化，分泌胶原纤维，修复损伤部位。在IPF情况下，促纤维化因子的持续分泌，形成过量胶原纤维，最终对肺造成不可逆损伤。在肺受损组织中，TGF-β是主要的促纤维化细胞因子，整合素是由α和β亚基组成的异二聚体跨膜受体，在TGF-β的活化和释放中起重要作用［56］。

在硬皮成纤维细胞中，mTOR信号通路可通过αVβ3整合素调节TGF-β释放及和胶原的合成［57］。在平阳霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，西罗莫司通过对mTOR的阻断下调PDGF和低氧引起的趋化因子受体CXCR4+纤维细胞表达的增加，减少肺内胶原沉积［58］。在早产大鼠氧化应激性肺损伤纤维化模型中，西罗莫司抑制mTOR信号通路的活化可减少TGF-β和CTGF表达，抑制肺胶原沉积［59］。以上数据表明，mTOR信号通路参与了促纤维化因子的释放，但在IPF中相关研究较少，其具体作用机制仍需进一步探索。

2 靶向mTOR治疗IPF临床用药

基于mTOR信号通路在IPF中重要作用，靶向mTOR信号通路开发抗IPF药物也逐渐受到更多的关注。目前正在临床研究的药物有3个，分别为西罗莫司、奥米帕西（omipalisib）和HEC-68498。

2.1 西罗莫司

西罗莫司是mTOR高选择性抑制剂，该药在系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）中具有一定的免疫调节作用和抗纤维化作用。其可抑制平阳霉素诱导的小鼠成纤维细胞增殖和胶原合成，且呈剂量依赖性，并且西罗莫司还可抑制白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素17和TGF-β1等致纤维化细胞因子的产生［60］。在西罗莫司诱导的大鼠肺纤维化模型中，西罗莫司抑制肺泡灌洗液中的纤维化因子表达水平，降低肺组织羟脯氨酸含量，改善组织病变，使组织病理切片纤维化评分显著下降［61］。在TGF-α转基因过表达肺纤维化小鼠模型中，肺内诱导TGF-α基因的表达导致进行性肺纤维化。mTOR是该模型诱导的肺纤维化的主要效应物，每天服用西罗莫司可防止肺胶原蛋白堆积、小鼠体质量减轻和肺力学改变，可防止由EGFR激活引起的肺纤维化进一步增加［62］。西罗莫司和吡非尼酮联用，显著抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，扩大了纤维化标志物的抑制范围，阻止了成纤维细胞迁移等［63］。2005年，一位IPF病史为2个月的73岁女性，利用类固醇和干扰素γ-1b治疗未能改善其临床病程；但开始用西罗莫司治疗后，其纤维化进程在数周内得到了明显改善［64］。

目前西罗莫司治疗IPF的临床试验Ⅰ期已完成（NCT01462006），其试验结果尚未公布，但其在肺纤维化细胞、动物模型和临床案例中都显示出一定的治疗优势，且与吡非尼酮联用也显示出优于吡非尼酮单用的治疗效果。

2.2 奥米帕西

奥米帕西（GSK2126458）是葛兰素史克研发的一种结构新颖的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂，具有针对PI3Kα和mTOR的双重活性，最初开发的适应证为实体瘤或淋巴瘤。该药已完成了Ⅰ期临床试验。IPF与肿瘤之间发病机制的相似性已得到越来越多的认识，如病理情况下，PI3K/mTOR信号转导驱动异常，所以该药也被用于IPF的治疗研究。

实验证实，该药能以浓度依赖方式减少TGF-β1诱导的所有纤维化生物标志物，并且包括不受吡非尼酮影响的α-肌动蛋白［65］。该药可抑制IPF纤维化灶内PI3K信号的转导，并通过抑制mTOR信号通路减弱人肺成纤维细胞中TGF-β1诱导的胶原蛋白的产生以及IPF患者肺组织中胶原蛋白的形成［66］。该药对IPF的治疗作用在进行临床评估中，目前Ⅰ期临床试验已完成（NCT01725139），试验结果尚未发布。

2.3 HEC-68498

HEC-68498是我国东阳光药业研发的PI3K和mTOR的双重靶点抑制剂，用于治疗IPF和实体瘤。2018年4月，在我国开展针对IPF的Ⅰ期临床试验（NCT03502902）。目前在我国仍处于临床Ⅰ期，研究已通过其完成日期，但具体情况未公布。

3 结语

mTOR信号通路可在多方面、多阶段和多效应调控IPF进程，并发挥着重要作用。①在AEC中，mTOR信号通路可抑制AEC的凋亡和炎症反应，并通过自噬维持细胞稳态，提高其抵抗外界刺激的能力；②在成纤维细胞中，抑制细胞中mTOR通路可抑制成纤维细胞的活化和ECM蛋白沉积，有效缓解肺纤维化。且抑制mTOR通路可增强细胞自噬、增强成纤维细胞对凋亡的敏感性；③在维持上皮表型中，抑制mTOR信号通路可抑制上皮细胞中E-钙黏蛋白的下调和纤连蛋白的上调，降低接受EMT的AEC的比例；④抑制mTOR通路可减少肺部致纤维化因子如TGF-β，CTGF和PDGF等的释放，抑制胶原沉积。

mTOR抑制剂可能在肺纤维化中具有独特的优势，针对mTOR信号通路进行IPF的治疗研究和相关抑制剂的开发具有重要意义。目前，Akt/mTOR抑制剂开发在肿瘤治疗中已成为热点，但在抗IPF中并未受到更多的重视，且进展缓慢。在动物实验中，mTOR单药在抑制α-肌动蛋白表达上明显优于上市药物吡非尼酮，且与吡非尼酮联用明显优于吡非尼酮单用。开发mTOR选择性抑制剂或开发mTOR抑制剂与上市药物联用制剂可能成为抗IPF药物的突破口。

mTOR信号通路在体内生理调控中发挥着重要作用。病理情况下，mTOR信号通路异常的机制尚未明确，其与各通路间相互调控的机制网络尚不清晰，mTOR抑制剂在这种疾病背景下的靶点参与和耐受性也需要进一步验证，以便开发出维持机体正常生理活动的同时选择性和安全性更好的治疗剂。