抗氧化剂对家畜胚胎体外发育影响的研究进展

金 磊， 张子敬， 朱肖亭， 吕世杰， 黄永震， 王二耀， 徐照学， 施巧婷*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；3.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002；4.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

1 抗氧化剂的分类及功能

机体的正常生命活动都在不断产生自由基，正常情况下机体内相应抗氧化酶(超氧化物歧化酶，过氧化氢酶等)，可以清除一部分自由基，使氧化还原处于动态平衡状态。但在各种因素刺激下，如高氧、环境应激等，自由基的清除就会遭到破坏，机体正常生长发育受到影响，导致胚胎发育阻滞。目前，用于清除自由基的抗氧化剂通常分为来自体内的酶类抗氧化剂和来自体外的非酶类抗氧化剂两类。前者主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化物酶(POD)等；后者主要有维生素C、维生素E、谷胱甘肽(GSH)、白藜芦醇、姜黄素、褪黑素、微量元素硒等。

2 酶类抗氧化剂

2.1 超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是存在于机体细胞内的一种抗氧化金属酶，它通过催化超氧阴离子自由基使其转化成氧和过氧化氢，过氧化氢在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的催化下还原成水和氧气，二者在机体的氧化和抗氧化平衡中起到重要作用， 并与许多疾病有着密切关系[5-6]。SOD催化中心含有1个金属阳离子，根据金属离子的不同，SOD家族分为Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD 4种[7]。Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在真原核生物中均有存在，Fe-SOD主要存在于原核生物和植物的叶绿体中，目前只在链霉菌属和蓝细菌中发现Ni-SOD存在。Nagasaka等[8]研究表明，Cu/Zn-SOD增多会减轻因氧化物增加引起的肝损伤。马瑛等[9]研究表明，在斑马鱼胚胎早期由于耗氧量低，SOD含量也较低；在胚胎中后期由于需氧量的增加，SOD含量升高从而清除过量的活性氧，防止ROS对遗传物质的毒害作用，保障胚胎能够正常发育。

谷胱甘肽过氧化物酶可根据分子中是否含硒分为：硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px)和谷胱甘肽转硫酶(GST)，二者均可以清除体内产生的过氧化氢。在过氧化氢酶含量很少或H2O2量很少的组织中，如脑、精液，GSH-Px可代替过氧化氢酶清除组织中H2O2[10]。另有研究表明给小鼠腹腔注射谷胱甘肽活性酶抑制剂后可显著降低小鼠胚胎的妊娠率[11]。

2.2 过氧化氢酶

过氧化氢酶可清除超氧化物歧化酶歧化超氧阴离子自由基(O2-)产生的过氧化氢(H2O2)，保护并提高了SOD酶活性；还可清除从其他部位扩散的H2O2，使其分解为水(H2O)和氧气(O2)，从而使胚胎免于遭受 H2O2的毒害。Julia等[12]的研究表明，小鼠胚胎发育畸形率随着过氧化氢酶活性的降低而增加，加入外源过氧化氢酶可以阻断该现象。然而有研究表明，随着年龄的增长体内过氧化氢酶浓度逐渐降低，妊娠率逐渐降低，但胚胎质量与过氧化氢酶浓度无关[13]。Yasushi等[14]研究证实，在小鼠的体外胚胎培养中，事先对精子进行过氧化氢酶预处理，处理组其囊胚率及孵化囊胚率显著升高。

3 非酶类抗氧化剂

3.1 维生素C和维生素E

维生素C(vitamin C，VC)又叫L-抗坏血酸，具有较强的抗氧化性，它可提供电子使Fe3+还原为Fe2+，后者可以维持胶原酶的活性而起到抗坏血病的作用；还可以使氧化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽，后者可清除活性氧自由基，保护胚胎发育。据Hu等[15]的报道，在猪胚胎体外培养时，当加入VC(20 mg/mL)后胚胎内ROS水平显著下降，且囊胚率及囊胚细胞数显著增加。说明VC抑制了ROS对胚胎的毒性作用。然而Hossein等[16]研究结果显示，一次性单独添加VC并不会对猪胚胎的体外发育产生影响，当分两次进行添加时囊胚率显著升高。这有可能是因为胚胎发育不同阶段产生ROS的量以及对ROS的敏感性不同。研究证实，一定的VC还可以提高牛，羊卵母细胞的体外成熟率和卵裂率[17-18]。

维生素E(vitamin E，VE)是一种脂溶性抗氧化剂，主要保护细胞免受自由基的损伤，提高胚胎发育能力。已被证实添加VE可以提高牛[19]、老鼠[20]、羊[21]、猪[22]等胚胎发育潜能。据报道VC还参与了VE的再生，保证了VE作为抗氧化剂可以被不断重复使用，并通过和自由基反应防止VE被氧化。然而据Dalvit等[23]报道，在牛的体外成熟培养液中同时添加VC和VE其囊胚率却显著低于单独添加组，这和Hossein等[16]在猪上的研究结果相同，然而当将VC和VE分2次添加(0和96 h)，其囊胚率与胚胎质量显著提高。

3.2 白藜芦醇

白藜芦醇是一种生物性很强的多酚类化合物，具有细胞内抗氧化功能。近年来，有关白藜芦醇对胚胎体外发育的促进作用得到越来越多的证实。Wang等[24]研究发现，在牛卵母细胞体外成熟培养液中加入白藜芦醇提高了卵母细胞成熟率和体外受精囊胚率，并且其细胞内ROS水平显著降低。据Kwak等[25]的报道，在猪卵母细胞体外培养中添加2 μmol/L白藜芦醇预处理可提高胚胎囊胚率以及胚胎发育潜力，并且抑制了Caspase-3的表达，降低了卵母细胞凋亡率，然而当加入10 μmol/L白藜芦醇，胚胎卵裂率和成熟率明显降低。说明白藜芦醇的生物学作用具有剂量依赖性，浓度过高便会产生不利影响。Mukherjee等[26]研究表明，在山羊卵母细胞体外培养中添加白藜芦醇可提高GSH水平，提高孤雌胚胎和克隆胚胎的发育潜力，说明白藜芦醇可通过提高细胞内谷胱甘肽水平，改善胚胎发育潜能。Daichi等[27]研究发现，在猪卵母细胞成熟液中添加白藜芦醇，可增强沉默信息调节因子(SIRT1)的表达，使线粒体功能增强，从而促进卵母细胞的发育。在牛卵母细胞体外培养中也得到相同结论[28]。

3.3 谷胱甘肽

谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，是细胞内一种重要的抗氧化物质。GSH能维持卵母细胞在减数分裂过程中纺锤体的形态并防止其被氧化，对胚胎的后续发育起着重要作用。Timme-Laragy等[29]以斑马鱼为实验模型研究发现，在胚胎发育过程中，GSH与胚胎内氧化应激有关，通过清除ROS来保护半胱氨酸免受氧化损伤，并且GSH还与胚胎代谢系统和DNA的甲基化有关。Zuelke等[30]在仓鼠上的研究发现，MⅡ期卵母细胞中每枚卵母细胞约含3.24 pmol/L的GSH，而在囊胚阶段则仅有0.29 pmol/L，约占MⅡ期GSH含量的9%。说明胚胎发育的不同阶段GSH含量也呈现明显差异，随着分裂分化的进行而逐渐降低。在猪胚胎体外培养中添加GSH，能够有效促进ICSI胚胎的卵裂率和囊胚率，并且囊胚凋亡细胞数显著降低，提高了胚胎质量和发育潜力，同时也降低了胚胎内源ROS，对胚胎起到很好地保护作用。在牛胚胎体外发育实验中也得到相同结果，但浓度过高则会产生不利影响[31-32]。据孙尉峻[33]研究报道，3 mmol/L为外源GSH在牛胚胎体外培养中最适添加浓度，能显著提高囊胚发育率和早期囊胚总细胞数，并能够促进2-4细胞期胚胎内源性GSH的增长。而据李凤[34]研究发现，外源GSH通过γ-谷氨酰循环促进牛胚胎内GSH的合成和胚胎的体外发育，并且GGT酶和GCL 酶在其中扮演了重要角色。

3.4 褪黑素

褪黑素(melatonin，MT)是一种具有抗氧化能力的胺类激素，褪黑素可以激活MT1和MT2这两种G蛋白偶联受体，这两种受体对卵母细胞的生长具有调节作用。王淑娟等[35]在牛的胚胎体外培养中发现，添加褪黑素可显著提高卵母细胞成熟率和胚胎发育潜能，并且MT1受体的表达量随胚胎的发育而升高。Zhao等[36]研究也有相同结论。MT作为一种有效的抗氧化剂可显著降低细胞内ROS水平，改善卵母细胞的体外成熟与胚胎的体外发育潜能。Gitto等[37]研究表明，与VA、VE和N-乙酰半胱氨酸相比，MT更有利于卵母细胞的成熟。有研究证实MT对小鼠[38]、猪[39]胚胎体外发育也具有显著促进作用。作为抗氧化剂，MT可以显著减少体外培养细胞的凋亡，改善胚胎质量。有研究证实，MT可抑制绵羊颗粒细胞在热应激情况下引起的增殖减少和凋亡率增加[40]。Su等[41]研究表明，MT可抑制促凋亡基因p53和Bax的表达，并促进抗氧化基因SOD1和Gpx4，抗凋亡基因BCL2L1和多能性相关基因SOX2在胚胎中的表达。

4 小 结

卵母细胞和胚胎发育过程中细胞内的氧化和还原平衡对其发育至关重要，在体外培养中这种平衡很容易被打破，所以需要加入相关抗氧化物质以减少ROS对胚胎造成氧化损伤。了解胚胎的抗氧化机制也有助于培养液的优化，从而提高卵母细胞体外成熟率和胚胎发育潜能，为胚胎体外生产奠定基础。