基于铁死亡Xc-/GPX4通路探究夹脊电针促进脊髓损伤修复机制*

李 全，栾逸先，朱荟一，尹洪娜

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是由于外伤、疾病或先天性因素，导致神经损伤平面以下的感觉和运动功能部分或全部障碍。其高发人群多为青壮年(平均年龄40.7岁)[1]。SCI后由于短期内需要高水准的急症护理和长期需要治疗相关继发性并发症，所以需要大量的医疗保健资源，给患者和他们的家庭及社区带来沉重的经济负担。在全球，SCI的男性比例高于女性，但是不同国家的男女比例差别很大，发病高峰年龄为15～30岁,患病率在过去几十年来一直呈上升趋势。

脊髓损伤症状表现可归属于中医学的“痿证”范畴,又有医家称之为“体惰”[2]。临床可根据脊髓损伤的症状表现和中医学的“痿证”辨证施治，《针灸甲乙经·卷之十》首次提出“治痿独取阳明”“各补其营而通其腧，调其虚实，和其逆顺”的治疗原则[3]，这一原则对于脊髓损伤的治疗影响至今。《针灸资生经·第五》也指出治疗下肢痿躄、麻木不仁多用阳经穴位,记载：“阳辅、阳交、阳陵泉主髀枢膝骨痹不仁……阳关、环跳、承筋主胫痹不仁……腰俞、风府主足不仁，膀胱俞、太溪、次髎主足痉不仁，阳关主胫痹不仁……白环俞疗手足不仁……废其肾则足不能行，当灸肾俞”[4]。总结历代医家的学术思想，痿证的病因病机主要由火热、湿热、痰湿、气虚、血虚、瘀血及情志失调等致病因素导致五脏受损、经络不通，以虚证为主，虚实夹杂者亦不少见。例如急性脊髓炎之症状表现多由于肺热袭肺、先实后虚、虚实夹杂所致。脊髓空洞症之症状表现的病机往往为肝肾亏虚。而外伤性脊髓损伤由不内外因导致，例如坠堕、撞击、跌仆、闪挫及负重等，导致瘀血或出血过多，瘀血导致督脉受阻、脉道不通或失血元气大伤、气血衰弱无以濡养四末，同时五脏阳气供养不足，体虚外邪侵入，一损俱损，五脏失衡，肾精耗伤，肾主骨生髓，髓不得滋养，肾又开窍于二阴且主生殖，所以可以出现二便失常、性功能障碍的临床表现。由此可见外伤性脊髓损伤需首辨虚实再加以施治。根据中医理论和历代医家总结，针刺足阳明与督脉穴位可以有效的治疗痿证，临床中常选用内关、足三里、委中及三阴交等穴治疗本病。随着针灸研究的深入，历代医家发现针刺损伤节段夹脊穴对于治疗本病疗效显著，夹脊针刺方法便广泛应用于临床。

随着现代医学的发展，结合现代研究发现电场对于脊髓损伤的恢复具有明显的疗效。临床应用发现将传统针刺疗法与电场结合治疗一些疾病能起到极好的治疗效果，从此夹脊电针的应用成为了目前中医治疗SCI的首选疗法[5]。随着现代分子生物学的科学技术发展，现代研究表明夹脊电针改善脊髓损伤运动功能恢复机制目前包括抑制细胞凋亡[6]、改善微环境[5]、促进神经再生和抑制炎症反应[7]等。近几年研究重点在于夹脊电针通过抑制细胞死亡促进脊髓损伤恢复，其机制包括细胞的自噬、焦亡及凋亡等方面。最新研究表明，一种新的细胞死亡方式——铁死亡与已知的细胞死亡方式有着密切的联系，并且发现夹脊电针可以通过此机制促进脊髓损伤的修复，本研究重在论述夹脊电针通过铁死亡Xc-/GPX4通路促进SCI恢复的相关机制。

1 脊髓损伤后细胞死亡的传统机制

脊髓损伤后的病理生理过程一般可以分为原发性损伤和继发性损伤：原发性损伤是指脊髓遭受到的机械性或物理伤害，其后果是不可逆的；继发性损伤是指发生于脊髓原发性创伤后的一系列病理生理以及生化的改变，包括出血水肿、局部缺血再灌注、炎症反应、Ca2+溢出、活性氧自由基损伤、兴奋性氨基酸的毒性作用、电解质失衡及神经细胞死亡等，使最初病灶周围完整的组织发生自身破坏性病变[8-10]进一步加深损伤程度并扩大损伤范围，而脊髓损伤修复的关键集中在如何有效抑制继发损伤造成的一系列破坏。细胞死亡是各种物理和化学因素作用的结果，包括程序性细胞死亡和非程序性细胞死亡。其中非程序性细胞死亡被认为是“偶然”因素导致的死亡，是物理和化学因素直接作用的结果，无法进行调控。因此，控制细胞的程序性死亡就成为恢复脊髓损伤的关键。

2 细胞程序性死亡新发现——铁死亡及Xc-/GPX4通路

目前研究认为程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)之细胞凋亡、细胞自噬、细胞坏死以及铁死亡均参与了包括SCI在内的多种神经系统疾病的病理生理过程[11]。在继往的细胞死亡研究中发现坏死细胞内出现铁离子(Fe3+)浓度升高现象，但未能对此现象给予明确的解释。2012年Cell杂志报道了一种新的程序性死亡机制，是铁离子和脂质活性氧(Reactive oxygen species,ROS)依赖的一种非凋亡程序性死亡途径，被命名为铁死亡(Ferroptosis)[12]，并在2017年Cell杂志上详细叙述了对其作用机制的研究[13]。其形态学特点是胞膜完整、没有起泡、无破裂；细胞聚集在一起，线粒体浓缩，线粒体膜增厚，线粒体减小或者消失，同时线粒体外膜破裂，细胞核正常，无染色体凝聚。科学研究表明Xcˉ/GPX4通路是其主要的发生途径之一[14]。同时过量的铁离子聚集会导致铁死亡的发生，芬腾(Fenton)反应会生成活性氧，循环铁以Fe3+依附在转铁蛋白的形式存在，Fe3+通过膜上的蛋白转铁蛋白受体1(TFR1)进入细胞，然后定位于细胞内。在核内体中，铁还原酶将Fe3+还原为亚铁离子(Fe2+)。最后,二价金属转运体1(DMT1，也称为SLC11A2)介导铁离子从核内体释放到不稳定的细胞质铁池中，多余的铁储存在铁蛋白中即含铁蛋白轻链铁蛋白复合物(FTL)和铁蛋白重链1(FTH1)。铁离子的出膜是由膜蛋白铁(也叫铁射流泵,也称为SLC11A3)激动的，其能将Fe2+氧化成Fe3+，细胞内铁离子的失衡导致了铁死亡的发生。同时铁死亡的发生取决于ROS是否过载，其将铁死亡发生过程分成上游(ROS产生)和下游(执行铁死亡)两个部分，ROS位于铁代谢途径、Xc-/GPX4通路和脂质代谢途径的交叉处，也受其他通路的共同调控。胱氨酸/谷氨酸逆向转运体Xcˉ系统是由机体细胞膜上SLC7A11和SLC3A2两个亚基组成的重要抗氧化体系，可按1:1比例将细胞外胱氨酸摄取入胞内，并被迅速还原成半胱氨酸，参与胞内重要自由基清除剂还原性谷胱甘肽(GSH)的合成。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸合成的细胞必要的氧化剂，由谷氨酸-半胱氨酸连接酶(Glutamate-cysteine ligase,GCL)和谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase,GSS)催化。谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)[15]将胞内GSH转化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同时将细胞内毒性脂质过氧化氢(L-OOH)转化为无毒脂醇(L-OH)[16]。GSH是身体主要的神经递质和内源性抗氧化剂，当其含量上升时会导致带有毒性的神经兴奋作用。当其调节系统失调时就无法抑制细胞对胱氨酸的摄取，细胞外的谷氨酸含量上升，细胞内的GSH减少从而诱发细胞发生铁死亡。同时细胞外System Xc-会产生氧化性谷氨酸毒性，可以加速细胞内GSH的消耗，从而导致细胞内过氧化物积累而引起细胞死亡。

胱氨酸在System Xc-的作用下进入细胞内反应生成半胱氨酸，与此同时细胞内的谷氨酸盐在System Xc-的作用下出细胞生成胱氨酸以维持细胞内外胱氨酸含量的平衡。半胱氨酸和谷氨酸盐在谷氨酸-半胱氨酸连接酶的作用下以甘氨酸和谷胱肽合成酶为原料反应生成GSH，在细胞内GSH在GPX4的作用下被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同时在此反应过程中GPX4也同时作用在具有毒性的PL-PUFA-OOH与无毒的PL-PUFA-OH的氧化还原反应中而影响细胞铁死亡的发生。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)[17]是erastin和RSL3诱导的铁死亡的中心调节因子，其调控的铁死亡是一个共同的机制，有多个独立的小分子支架。所有的鳍状化合物都可以根据GPX4抑制模式分为两类。第一类，包括erastin，通过消耗GSH抑制GPX4;第二类,如RSL3[18]，直接抑制GPX4而不耗尽GSH。

3 脊髓损伤后铁死亡与氧化应激、自噬、炎症反应的联系

在铁死亡中可以通过Xc-/GPX4通路中关键物质GSS、GCL、GPX4等调控细胞中GSH含量来抑制ROS从而抑制铁死亡的发生。这与机体抗氧化应激反应过程中机体减少体内高活性分子如ROS和活性氮自由基,(Reactive nitrogen species，RNS)的机理相同，通过提升GSH含量清除过多的活性氧自由基和活性氮自由基，保护了细胞和组织免受氧化应激的损伤[19]。同时脂质产物可以从谷氨酰胺转化成酮戊二酸。这一过程可以被小分子转氨酶抑制剂所阻断，活性氧可与脂质膜上的多不饱和脂肪酸(PUFAs)发生反应并诱导脂质过氧化，两个脂质代谢相关基因(溶磷脂酰胆碱酰基转移酶)3 (LPCAT3)和酰基辅酶a合成长链4 (ACSL4)已被确定促进生成RSL3和DPI7(也称为ML162)[20]。铁死亡的发生一定伴随着GPX4的失活，而GPX4的失活源于花生四烯酸(AA)和其他PUFAs的消耗。研究表明Nrf2是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，同时也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者。Nrf2通过诱导调控一系列抗氧化蛋白的组成型和诱导型表达，可以减轻活性氧和亲电体引起的细胞损伤，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡。正常生理情况下，Nrf2被Keap1锁定在细胞质中，当ROS发生时，Nrf2从Keap1中解离并进入细胞核中，先与小Maf蛋白形成异二聚体，再结合抗氧化反应元件(ARE)，转录激活受Nrf2调控的抗氧化酶基因表达[21-22]。Nrf2可以通过调控GSH生物合成的限速酶——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的生成而控制GSH的合成[23]。Nrf2还可以通过控制谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)表达调节GSH的再生，其在过氧化物的解毒过程中利用GSH作为辅因子，将其氧化成GSSG。随后，Nrf2调控的另一种抗氧化酶——谷胱甘肽还原酶(GSR)又利用NADPH作为辅因子，将上述GPX作用产生的GSSG还原再生为GSH[24]。所以Nrf2可以通过其表达影响ROS、GPX和GSH来调控铁死亡的发生,这正是细胞通过控制氧化应激反应抑制铁死亡的途径。因此，氧化应激反应与脊髓损伤后神经细胞铁死亡的发生密切相关。

自噬是一种受调控的分解代谢溶酶体依赖过程，它促进细胞消除受损或非功能性细胞成分(线粒体、内质网、过氧化物酶体)、错误折叠的蛋白质和病原体，以维持细胞的稳态[25-27]。细胞自噬中溶酶体的重要转运物质核受体辅活化子4(NCOA4)可以通过与铁蛋白结合来调节细胞内铁稳态来调节铁死亡的发生，同时还可以促进自噬的降解作用[28],实验表明NCOA4介导铁蛋白转运到溶酶体降解[29]，NCOA4的缺失可以通过抑制铁蛋白向溶酶体的传递而抑制铁蛋白的降解。铁蛋白转换的减少导致生物细胞内可利用的铁显著减少，改变了细胞内蛋白质的铁稳态[30]从而导致了铁死亡的发生。研究表明SCI后，p53、Beclin-1参与了AMPK/mTOR通路介导PI3K调节自噬，同时，p53[31]和Beclin-1[32]可以作用于Xc-系统中的SLC7A11蛋白上，通过调控细胞内外胱氨酸含量影响其稳态导致铁死亡的发生。因此，自噬与脊髓损伤后的铁死亡发生也密切相关。

脊髓损伤后，损伤局部严重的炎症反应是大量继发性损伤重要机制之一。在损伤局部微环境中，免疫细胞、促炎因子、趋化因子等都被证实发生广泛的变化。在最新研究中发现，炎症小体过度活化在脊髓损伤局部微环境变化中占据了重要的地位，可能是研究脊髓继发性损伤机制重要靶点之一。研究表明，SCI后运用药物抑制NLRP3炎症小体可以改善SCI后的神经恢复，证明NLRP3炎性小体是导致SCI模型继发性损伤的重要因素之一[31]。目前发现，在铁死亡中HMGB1的释放是一个普遍现象[32],其可以诱导正常的NLRP3、ASC、caspase-1和非正常capase-8-ASC炎症小体的升高，促进IL-1β的加工[33]。而HMGB1是氧化或还原态决定了HMGB1的功能特征，二硫态(DS-HMGB1)具有促炎功能。研究表明DS-HMGB1增加了离体小胶质细胞中NF-JBIA和NLRP3的表达，增强了小胶质细胞对脂多糖的促炎反应[34]。同时DS-HMGB1直接增强了小胶质细胞的免疫应答。研究证实铁死亡激活剂可诱导HMGB1的释放，通过ELISA分析发现铁死亡的发生增加了HMGB1的释放量。研究显示脂质运载蛋白-2(NGLA)通过HMGB1调控TLR4信号诱导NLRP3炎症激活，脂质运载蛋白-2通过增加IL-1β、IL-18和caspase-1的激活来增强NLRP3炎症小体的启动和激活。

4 夹脊电针与铁死亡

夹脊电针是通过现代医学研究手段，运用电场结合传统针刺疗法治疗相关疾病的一种治疗方法。在传统夹脊针刺治疗方法中引入电场，在临床治疗中取得了突出的疗效。既往对于夹脊电针治疗SCI的机制研究已经证实夹脊电针可以通过抑制细胞自噬、焦亡、凋亡和炎性反应等相关通路达到促进脊髓损伤修复的作用。研究显示夹脊电针可以升高细胞内LC3-Ⅱ的含量，同时降低P62蛋白含量，增加受损组织自噬流的发生，抑制神经细胞的凋亡；夹脊电针能有效降低NLRP3的表达，改善受损区炎性反应与环境，促进大鼠SCI恢复；夹脊电针可以通过抑制内质网应激因子Caspase-12与CHOP的表达，从而抑制脊髓神经细胞的凋亡。

已有研究发现，铁死亡是继发性SCI神经细胞死亡的主要机制，能够通过SRS 16-86抑制铁死亡Xc-/GPX4通路促进SCI的修复[35]。还有研究表明游离铁介导的脂质过氧化反应通常是脊髓继发性损伤所导致严重后果的重要原因之一。并证实在脊髓神经元的培养液中加入亚铁离子，发现神经元的脂质过氧化产物产生量与神经元失活呈正相关，并且脂质过氧化代谢产物同细胞内铁离子的水平具有明显的相关性。在脊髓损伤的动物模型中发现羟基铁离子可能是继发性脊髓损伤的一个重要原因，具有非常重要的作用，脊髓损伤后铁离子含量与脊髓的损伤程度呈正相关。实验表明，夹脊电针可以激活继发性SCI的Nrf2活性，通过Nrf2/ARE通路增加GSH的表达量降低过氧化反应，发挥抗氧化作用，促进脊髓损伤修复。而在铁死亡中GSH正是Xc-/GPX4通路中重要的抗氧化物质，可以上调GPX4的活性抑制铁死亡的发生；同时夹脊电针可以通过上调Beclin-1含量激发细胞自噬促进SCI的修复，而Beclin-1可以与铁死亡Xc-系统核心组分SLC7A11结合影响铁死亡，NCOA4与铁自噬蛋白的研究也将自噬和铁死亡紧密的联系在一起；同时夹脊电针可以通过抑制NLRP3炎症小体活化促进脊髓损伤修复，研究表明铁死亡可以控制HMGB1释放并上调NLRP3炎症小体活化，并且此过程伴有细胞自噬的参与。因此夹脊电针促进脊髓损伤修复与铁死亡Xc-/GPX4通路密切相关。然而，关于夹脊电针对于铁死亡的作用机制、氧化应激反应、自噬和铁死亡的关系、铁死亡影响炎性反应从而促进神经细胞再生的详细机制都仍待探索。

5 总结

近年来，对于脊髓损伤后脊髓和神经细胞的死亡方式以及相关的信号通路的研究已经取得了一些进展，对一些特殊靶点干预从而治疗脊髓损伤也取得一些成果，但夹脊电针促进脊髓损伤恢复的作用机制尚未完全明确，而铁死亡的发现对于脊髓损伤后神经细胞死亡的研究提供了新的思路。夹脊电针是临床中治疗脊髓损伤的常用手段，并且疗效显著，具有极好的临床治愈率。在既往研究中，通过对于夹脊电针作用于氧化应激反应、自噬、炎症反应的研究已对其机制有了大致的了解。但是研究结果大多孤立存在，而人体是一个有机的整体，各部分相互协调作用维持机体的正常。铁死亡的出现给研究夹脊电针促进脊髓损伤修复的机制提供了新的思路，也为将脊髓损伤中的氧化应激反应、自噬、炎症反应联系在一起提供了理论基础。因此，铁死亡的发现以及其发生途径中，多种基因的表达和蛋白质的生成与其他死亡方式产生交集的这些现象，为进一步解决上述问题提供了依据，也为发现新的干预靶点、促进脊髓损伤修复提供了新的方向。