近红外荧光成像技术在外科手术中的研究进展

刘丹丹 罗林 综述 崔永言 审校

近年来，现代外科技术迅速发展，各种高科技设备可以准确地实现病灶定位、病情评估及病情变化监测。随着分子影像学技术的不断发展，近红外荧光（near-infrared fluorescence，NIRF）成像技术在术中导航领域展现出了巨大的潜力。随着技术的不断成熟和发展，已逐渐应用于多个外科领域。本文就NIRF成像技术的临床应用研究进展进行综述。

1 NIRF的基本原理

NIRF成像技术主要由荧光探针和成像系统组成。首先通过静脉或局部注射荧光染料，再运用发光二极管或激光设备将该染料激发，成像系统捕捉其产生的发射光，并通过高级数据处理技术形成实时图像［1］。NIRF成像技术应用的荧光波长为650 nm～900 nm，该波段与可见光相比具有诸多成像优势。首先，它在生物组织中吸收率低，散射率低，因而具有更深的组织穿透力，显著增加成像深度。并且生物组织在该波段自体荧光较少，因而成像具有较高的信噪比和灵敏度［2］。同时，由于NIRF为不可见光，不会干扰手术视野，有助于其在术中应用［3］。基于上述优点，NIRF成像可以实现术中实时导航，显示未能直接暴露于表面的解剖结构，如血管、淋巴管、肝外胆管等。此外，应用荧光染料能够帮助识别肿瘤组织，在术中实时引导肿瘤切除。

1.1 NIRF探针

选择合适的荧光探针是NIRF成像技术应用的关键之一。目前用于显像的荧光探针主要分为3类：非靶向探针、靶向探针、智能探针。非靶向探针主要由于病变组织和正常组织的灌注及血管通透性不同，从而非特异地累积在病变部位，如吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）［4］。靶向探针通常由特异性配体偶联NIRF 基团构成，能够特异性识别靶组织［5］。智能探针在原始状态基本不产生荧光信号，通过一定的机制激活，则可转变为活性状态产生荧光［6］。由于肿瘤的异质性，选择合适的靶向配体至关重要。目前已有多种靶向配体获得批准应用于临床，如贝伐珠单抗（抗血管内皮生长因子A）、西妥昔单抗（抗表皮生长因子受体）等。将这些配体与NIRF载体相结合，在肿瘤成像方面将更为精确［7］。

目前虽然有诸多临床前研究对大量荧光探针进行了评估，但仅有IRDye 800CW 和ZW800-1 两种荧光分子正在进行临床试验，有望尽早完成临床转化。这两种化合物不仅可以与多种配体相结合，还可以用于输尿管和胆管的显像，具有极大的应用前景［1，8］。但临床转化所需的成本，应用的安全性及监管难度均限制了靶向探针及智能探针的临床应用［9］。

目前仅有非靶向探针-ICG被美国食品和药品管理局（FDA）批准应用于临床［10］。当ICG 受到激发后可以实现术中浅表血管和淋巴管的可视化显像。还可以借助实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），聚集于肿瘤组织，实现术中实时显像，指导肿瘤切除［4，11］。目前，ICG荧光成像已经广泛应用于前哨淋巴结定位，肿瘤切除实时引导等多个领域。

1.2 NIRF成像系统

NIRF术中实时显像依赖于各种成像系统，不同的成像系统在发射光源、激发波长、工作距离等多方面有所不同。理想的成像系统能够快速成像并且具备高信噪比，从而实时准确反应术中情况。目前成像系统主要分为3类：便携型成像系统、功能型成像系统以及内镜和腔镜下成像系统［2］。

2 临床应用

2.1 肿瘤切除实时引导

在肿瘤外科手术中，准确识别并完全切除肿瘤组织，尽可能保留健康组织，以及准确鉴别转移的淋巴结是影响肿瘤预后的重要因素。现阶段，术中寻找肿瘤边界主要依赖于肉眼观察和触摸。对肿瘤组织的判断易出现偏差；对于浸润性生长的肿瘤及微小转移灶更加难以识别，这也是造成术后复发的因素之一。上述问题都亟待精确的术中导航技术来解决。NIRF成像系统在术中利用肿瘤组织和正常组织的荧光成像差异，清晰显示肿瘤组织边缘和微小转移灶，以帮助外科医生进行术中决策。

应用NIRF实时指导外科手术可以提高病灶检出率。尽管靶向探针和智能探针能够与肿瘤组织特异性地结合，准确显示肿瘤边界。但是上述两种探针均尚未直接应用于临床。临床上主要应用已获批准的ICG作为荧光探针。对于大多数实体肿瘤，ICG可以非特异地在肿瘤组织中累积。这种累积主要源自灌注差异和EPR效应。静脉或局部注射ICG后，其与大分子血清蛋白结合后在血液中运行，肿瘤组织血运较正常组织更为丰富，存在的灌注差异使肿瘤与背景产生对比信号。此外，肿瘤组织内的血管壁间隙较宽，结构完整性差，且淋巴回流缺失，大分子物质可以透出血管进入肿瘤组织并积聚，这种积聚效应被称为实体瘤的EPR效应，ICG可以被动的累积于肿瘤组织，从而使肿瘤组织显像［4，12］。

Ishizawa 等［13］首次成功应用NIRF 对结直肠癌肝转移灶及肝细胞肝癌进行显像。术中发现的91处肿瘤中，有8处是肉眼无法识别的微小灶。该研究证明了NIRF成像可以发现此前肉眼难以识别的微小肿瘤组织。Uchiyama 等［14］进一步证明，NIRF 还可以发现术前CT 或MRI 忽略的微小病灶，从而影响外科医生决策。

上述研究中未被发现的病灶距离肝表面的距离均＜8 mm。NIRF 能够提高肝脏浅表病灶检出率，而这些病灶同时也是术中超声最易忽视的。Handgraaf等［15］将NIRF 与传统方法如触摸或术中超声相比较，可以发现更小的转移灶［（3.2±1.8）mm vs.（7.4±2.6）mm，P＜0.001］，从而防止肿瘤复发。尽管NIRF 成像的补充使用可以弥补传统技术在检测包膜下肝脏病变方面的困难，但仍需要术中超声检查以发现深处的肿瘤。Peloso 等［16］尝试术中联合应用超声和NIRF，成功地提高了微小病灶（＜3 mm）的检出率。

在内镜及腔镜系统下，NIRF 成像也得以运用。Boogerd等［17］在腔镜中应用ICG对多种类型肝脏肿瘤进行近红外光显像，并将其与传统检测手段如超声、CT、MRI 等相比较，NIRF 检测灵敏度高达92%，且当将术中超声与NIRF 两者联合应用时，灵敏度可达100%。未来，光声成像的发展可能会在术中超声图像上同时可视化癌组织中的荧光探针，从而使术中导航更为便捷，准确性更高［18-19］。

除识别微小灶外，NIRF 还可有效识别肿瘤切缘。NIRF是目前术中实时识别肿瘤切缘最有发展前景的技术之一。在Keating 等［20］的动物实验中，NIRF组检出了90%的阳性切缘，而对照组仅检出30%。在临床试验中，尽管病理结果显示所有的患者切缘均为阴性，但是有2例患者肿瘤阳性切缘与外科切缘相当接近，在其中1 例导管内癌患者中两者距离在1 mm以内，NIRF成像显示其切除创面的残余荧光信号背景比分别为2.91 和3.29（＞1.5 即视为具有残余肿瘤）。因此NIRF 成像在术中肿瘤切缘的决策方面或存在指导意义。尽管ICG 荧光成像在肿瘤切除实时引导方面非常具有前景，但是其存在的问题也不可忽视。由于ICG是非靶向探针，因而在一些肿瘤中应用效果不佳。Tummers等［21］应用NIRF进行卵巢癌转移灶的检测，假阴性率高达62%，良恶性组织间的肿瘤背景比无显著差异。

2.2 前哨淋巴结定位

临床上常规采取单独或联合应用放射性核素和生物蓝色染料如亚甲蓝、异硫蓝来进行淋巴结成像。尽管亚甲蓝的使用简单方便，但它会对手术视野产生干扰［22］。而放射性核素显像操作过程复杂，还会对正常组织产生放射性损害。相比之下，NIRF有其独特优势。

van der Vorst 等［23］在黑色素瘤的患者中，应用NIRF 成像及常规方法如蓝染法和99mTc 对前哨淋巴结进行检测，发现核素显像和NIRF 成像的检出率均为100%，而蓝染法仅为73%。Samorani等［24］在301例乳腺癌患者中应用近红外荧光造影与99mTc核素显像检测前哨淋巴结，在总检出的589 枚淋巴结中，NIRF的检出率高达99%，然而核素显像的检出率仅为77%；随后的病理活检发现70枚转移淋巴结，均未被核素显像识别，而NIRF 成像识别率为21%。该研究认为ICG荧光成像能够成为99mTc核素显像的替代方法。Emile等［25］通过回顾性分析248例大肠癌患者在内的十二项研究，NIRF 的合并敏感度和特异度分别为71%和84.6%，是具有潜力的术中导航技术。Kinami 等［26］在早期胃癌患者手术中应用NIRF 成像识别前哨淋巴结，发现其灵敏性、特异性及准确性分别高达90.1%、100%、98.6%。有研究证明NIRF 成像还可用于评估肺癌或其他恶性肿瘤在胸腔内的扩散［2］。

目前，NIRF 实时引导前哨淋巴结成像已经广泛应用于乳腺癌［27］、黑色素瘤［28］、结直肠癌［29］、子宫内膜癌［30］等多种肿瘤中。

2.3 保护正常解剖结构

在外科手术中，保护正常解剖结构，避免医源性损伤极为重要。NIRF 成像可以实时显示胆道系统，输尿管等重要解剖结构。尽管术中胆道及输尿管的损伤并不多见，但一旦发生便会引起严重的并发症。ICG由肝脏细胞摄入经由胆管分泌，应用该染料进行近红外荧光胆道造影（fluorescence cholangiography，FC）能安全、实时地显示胆道系统全貌，避免胆道系统损伤［31］。与术中经胆囊管胆道造影（intraoperative cholangiography，IOC）相比，FC 对重要结构具有更高的敏感度［32］。有研究表明在胆囊腺癌机器人根治性切除术中，在NIRF的辅助下，在靠近胆总管交界处进行高位胆囊管结扎术，所有患者均实现了阴性切缘。在复杂的再探索性胆道手术中表现极佳，术后30天未见重大并发症［33］。

3 临床应用局限性

在临床的应用过程中，由于ICG 是非靶向探针，它的累积不仅局限于癌组织，还可能少量积聚在炎症组织及创伤区域，在EPR 效应的初期阶段使得特异性降低。由于肿瘤组织淋巴引流结构的缺失，在肿瘤组织中的滞留率仍远大于炎症组织［34-35］。除此之外，与可见光一样，NIRF在活体组织中会因为吸收和散射而减弱。因此探测深度有限，对于穿透深度＜1 cm，位置较深的肿瘤，NIRF难以对其进行显像。在术中导航的应用中，也仅能推断出定性信息，评价荧光信号具有主观性，尽管校正后可提供定量测量，但相关研究仍处于初级阶段［36］。目前经临床批准的靶向探针仍然缺乏，在术中导航、实时引导肿瘤成像的精确性方面尚有待提高。

4 结语

应用ICG 进行NIRF 成像，不仅能够实时显示如胆管、血管、输尿管等重要解剖结构，避免医源性损伤，还能通过ICG或靶向探针、智能探针使肿瘤显像，同时将NIRF 与其他成像技术相结合如超声检查、X射线、CT、MRI和PET等，可以弥补深度问题，并且已经显示出精确切除肿瘤的可能性，能够实时引导肿瘤切除，定位前哨淋巴结，真正实现手术导航，帮助外科医生进行术中决策。

本文通过对NIRF 在临床的应用进行总结，以期对未来应用此类技术提供思路。NIRF现已经开始被越来越多的外科医生所重视，它扩展了传统手术观念，随着新技术的不断发展和新设备的不断涌现，NIRF 成像的研究范围将不断扩大，有望为人类疾病诊断和治疗提供一种崭新的方法。