ARID1A基因突变或失表达介导肿瘤发生的机制及其在胃癌免疫治疗中的价值*

王璇 刘宝瑞 综述 魏嘉 审校

AT 丰富结合域1A（AT-rich interactive domain 1A，ARID1A）基因在多种肿瘤中均有较高的突变率，如卵巢透明细胞癌（40%～57%）［1-2］、胃癌（18%～27%）［3-4］、肝细胞癌（10%～17%）［5-6］、乳腺癌（5%～15%）［7-8］等，这些突变大部分是移码突变或无义突变，会导致ARID1A 蛋白表达的缺失，从而导致其抑制肿瘤作用的丧失。ARID1A 的突变或表达缺失可能通过多种途径导致肿瘤的发生。近年来肿瘤免疫治疗发展迅速，程序性死亡受体-1（programmed cell death-1，PD-1）以及程序性死亡受体配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）检查点阻断治疗在多种肿瘤治疗上取得了较好的效果，其中包括胃癌［9］。然而该免疫治疗并非对所有患者均有效，仅一部分患者能够对PD-1/PD-L1阻断治疗产生应答，因此挑选出可以预测肿瘤能否对免疫治疗产生应答的生物标记物至关重要。具有PD-L1 高表达、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）阳性、微卫星高度不稳定性（microsatellite instability-high，MSI-H）、高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）及较多的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）的胃癌患者对于PD-1单抗有较高的敏感性和应答率，这些指标可以作为预测胃癌免疫阻断治疗疗效的生物标志，ARID1A的突变或表达缺失与这些生物标志存在密切的联系。

1 ARID1A的结构和功能

ARID1A基因是一个肿瘤抑制基因，定位于染色体1p35.3区域，有着丰富的A-T 序列，其编码蛋白具有ATPase 活性，在多种肿瘤中有着高频率的失活突变，它编码了BRG1 相关因子250a（BAF250a），是SWI/SNF 染色质重塑复合体的一个重要组成亚基。有研究发现，ARID1A基因能够通过调控细胞周期以及介导细胞凋亡来控制细胞增殖［10］，并且可以通过促进DNA 损伤修复和错配修复（mismatch repair，MMR）来维持基因组的稳定性［11］。ARID1A还可以通过与上游DNA损伤检查点激酶共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3 相关蛋白（ataxia telangiectasia and rad3-related，ATR）的相互作用被招募到DNA双链断裂（double strand breaks，DSBs）处，促进DSBs 转变为单链末端，来维持DNA损伤应答信号［12］。ARID1A可以通过调控STAG1 的表达来控制端粒的内聚，ARID1A 功能的缺失会引起STAG1 表达下调，从而导致细胞有丝分裂期间端粒的缺陷以及染色体畸变（如后期桥、落后染色体或染色体融合）［13］。ARID1A 在肝脏等多种组织中起到抑制再生的作用，在小鼠模型中，ARID1A 的缺失可以提高组织修复能力，改善手术切除和化学损伤后的器官功能［14］。

2 ARID1A 基因突变或失表达导致肿瘤发生的可能机制

2.1 ARID1A突变与MMR缺陷

MMR 是机体DNA 修复机制的一种形式，主要通过纠正碱基错配来防止基因突变以及维持基因组稳定性。MMR 蛋白的丧失会导致DNA 复制错误的累积特别是位于短串联重复序列基因组的区域，这种现象称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）。与临床密切相关的MMR 蛋白有MLH1、PMS1、PMS2、MSH2、MSH6等。有研究发现，ARID1A蛋白的C 端1600～1800 氨基酸区域和MMR 蛋白MSH2的N端可以介导它们的相互作用，在DNA复制时促进MMR，减少错配发生［11］。已有多项研究表明，ARID1A失表达与肿瘤的MMR缺陷或MSI状态相关，在子宫内膜癌中，ARID1A 阳性表达的肿瘤中MSI 型约占10%，ARID1A 表达缺失的肿瘤中MSI 型约占63%，具有显著的差别［15］。在食管癌患者中，ARID1A缺失型腺癌有32%为MMR 缺陷，而ARID1A 表达阳性的腺癌仅有1%为MMR缺陷［16］。Inada等［17］的研究发现，ARID1A 失活与胃腺癌的淋巴管浸润、淋巴结转移、不良预后以及MMR缺陷有关，ARID1A异常表达（表达减少或完全失活）的肿瘤更加频繁地表现出MMR 功 能 缺陷，38 例MMR 基因 缺陷 患 者有18 例（47.4%）出现ARID1A 异常表达，而在451 例MMR 蛋白表达完整的患者中，仅91例（20.2%）的ARID1A表达异常［17］。Wang等［3］对22例胃癌样本的全外显子测序发现，ARID1A 在MSI 型（78%）和微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）+EBV 型（47%）胃癌中突变率显著高于MSS 非EBV 型（10%），这些研究均说明了ARID1A 突变与MSI 型胃癌以及EBV 阳性胃癌类型高度相关，这两种亚型均被认为是目前能从免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗获益的胃癌亚型。

2.2 ARID1A与细胞周期阻滞

人类肿瘤的发生在很大程度上是由于多种基因改变的累积，包括突变、缺失、易位和扩增等，而ARID1A 可以调节细胞周期特异性基因的表达，对细胞周期阻滞及受损DNA的修复至关重要［12］。在分化过程中，含ARID1A 的SWI/SNF（SWItch/Sucrose nonfermentable）复合物直接靶向并抑制E2F 应答启动子以及c-myc启动子，后者的抑制对p21的诱导起重要作用［18］。ARID1A和ARID1B在细胞周期中也表现出不同的表达水平，ARID1A 在G0期积累，并在细胞周期的各个阶段中下调，在有丝分裂期间完全消除；而ARID1B 在整个细胞周期，甚至在有丝分裂期间，都有较高的表达水平［19］。当DNA 损伤时，特别是在双链断裂时，ARID1A通过与上游DNA损伤检查点激酶ATR 的相互作用被招募到双链断裂中，停滞细胞周期，防止将受损（未修复）的DNA 传递到下一个细胞周期。而ARID1A 缺失在DNA 损伤反应中不能启动和维持细胞周期阻滞，从而导致细胞周期检查点的激活缺陷［12］。

2.3 ARID1A与上皮-间充质转化

上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指细胞细胞失去上皮特征，获得间充质特征的过程，通常被定义为上皮标志物E-钙黏素（Ecadherin）的丢失和间充质标志物波形蛋白（vimentin）表达的增加。EMT 与肿瘤的多种生物学行为有关，包括肿瘤发生、恶性进展、迁移、脉管侵犯和耐药性等［20］。在胃癌细胞系中ARID1A 表达沉默后，vimentin和N-钙黏素（N-cadherin）的表达升高［21］。免疫荧光分析显示当ARID1A 在HGC-27 细胞中表达沉默时，细胞膜上的E-cadherin几乎完全消失，而β-连环蛋白（β-catenin）在胞浆和细胞核中分布增加。这些结果表明ARID1A 沉默破坏了细胞膜结合的E-cadherin/β-catenin复合物，并诱导β-catenin重新定位到细胞核中。细胞核中的β-catenin能够激活淋巴样增强因子-1/T 细胞因子（lymphoid enhancer factor-1/T cell factor，LEF-1/TCF）转录，启动EMT过程［21］。也有研究表明，在小鼠子宫内膜上皮细胞中ARID1A可以与EMT 相关基因的启动子结合，抑制EMT 发生，当ARID1A 敲除后，这种抑制被解除，EMT 相关基因表达增加［22］。ARID1A 突变的胰腺癌细胞系具有更高的间充质性、迁移性、侵袭性。基因表达分析显示，EMT 和干细胞识别通路的激活部分依赖于ARID1A失活［23］。在肾癌细胞中，用siRNA 沉默ARID1A 后，肿瘤细胞表现出EMT 特征，具体表现为纺锤体指数（spindle index）增加，间充质标记物［纤维连接蛋白（fibronectin）和vimentin］增加，上皮标记物（E-cadherin和zonula occludens-1）减少［24］。

2.4 ARID1A与TP53

有研究发现，在卵巢癌细胞系和小鼠移植瘤模型中保留ARID1A 的表达则抑制肿瘤生长，而沉默ARID1A的表达可促进细胞生长和致瘤性。在与p53免疫共沉淀的实验中，ARID1A 通过C 端区域与p53共沉淀，表明两者之间存在直接的相互作用。ARID1A 基因调控的下游靶基因中，细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）和SMAD 蛋白家族3（mothers against decapentaplegic homolog 3，SMAD3）同时也是p53 的靶基因，而且ARID1A对其的调控必须依赖p53，这一发现为ARID1A 作为抑癌基因与p53 协同调控卵巢癌和子宫内膜癌细胞中CDKN1A和SMAD3的转录和肿瘤生长的假说提供了功能性证据。此外这项研究中77 例卵巢透明细胞癌和子宫内膜样癌中，34 例ARID1A突变型肿瘤均是TP53野生型，6例TP53突变型肿瘤均是ARID1A野生型［25］，在其他肿瘤如肝内胆管癌中也发现了ARID1A突变和TP53突变的负相关性［26］，说明在不同癌种中ARID1A 突变和TP53 突变的互斥性是类似的，这种互斥性的相关机制尚未明确。

2.5 ARID1A与肿瘤发生、发展相关信号通路

SWI/SNF 可以通过ARID1A 与Yes 相关蛋白/转录共激活因子PDZ 结合基序（Yes-associated protein/transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，YAP/TAZ）结合，使其不能在细胞核内与TEA 结构域转录因子（TEA domain transcription factor，TEAD）结合，无法进一步诱导下游靶基因的转录，从而抑制YAP/TAZ 介导的肿瘤发生。在小鼠模型中，敲除肝脏ARID1A 及神经纤维素2（neurofibromin 2，NF2）基因以上调YAP 之后，观察到了明显的肝脏体积增大和肿瘤发生，验证了ARID1A对YAP/TAZ的核内抑制作用［27］。在胃癌中，ARID1A-SWI/SNF可以直接与磷酯酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-hydroxy Kinase，PIK3CA）和丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）的启动子结合，抑制其转录，影响PI3K/AKT通路的磷酸化。当ARID1A 缺失时，胃癌细胞增殖速度加快、细胞体积增大、糖摄取量增加，且这种细胞的增殖、体积生长和糖摄取的增加可以被靶向AKT 和PI3K 的抑制剂MK2206 和LY294002 抑 制［28］。联 合PI3K 抑 制 剂BKM120 和PARP（poly ADP-ribose polymerase）抑制剂奥拉帕尼（olaparib）对ARID1A 表达缺陷的胃癌细胞有明显的抑制作用［29］。EZH2可以抑制Th1型趋化因子CXC趋化因子配体9（C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）和CXCL10 的功能，并在多种癌症类型中发挥致癌作用，ARID1A 通过其羧基末端与EZH2 相互作用，拮抗EZH2 介导的抑制作用，ARID1A 对EZH2 的拮抗作用是ARID1A 调控肿瘤细胞IFN 信号基因表达的机制之一［30］。Bitler 等［31］研究发现在ARID1A 突变的卵巢透明细胞癌细胞中，EZH2甲基转移酶抑制剂能够以合成致死的方式起作用，导致ARID1A 突变的卵巢肿瘤在荷瘤小鼠体内消退。EZH2 抑制剂治疗晚期实体瘤的多个Ⅰ期或Ⅱ期临床试验正在进行中，ARID1A的突变状态可能成为一个具有临床价值的生物学标志。

3 ARID1A与胃癌免疫治疗

3.1 ARID1A突变或表达缺失与胃癌亚型

2014年一项基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的研究对295 例原发胃癌进行了综合分子分析，将胃癌分成了EBV阳性、MSI、染色体不稳定性（chromosomal instability，CIN）和基因稳定（genomically stable，GS）4 种亚型，弥漫型胃癌主要归类于GS 亚型，这4 种亚型在总生存期（overall survival，OS）或无病生存期方面均无显著差异［32］。Cristescu 等［33］将亚洲癌症研究组（the Asian Cancer Research Group，ACRG）中300 例胃癌病例基于MSI 状态、p53 和EMT 基因表达特征分为MSI、MSS/EMT、MSS/TP53-和MSS/TP53+共4 种亚型，其中弥漫型胃癌可归类于具有EMT 特征的微卫星稳定组（MSS/EMT），预后最差。考虑到弥漫型胃癌的分子异质性，Kim 等［34］基于基因表达谱将弥漫型胃癌进一步划分为N型（the normal-like）、INT型（intestinal-type-like）和COD 型（core diffuse type），研究发现INT 型胃癌和COD型相比，PIK3CA和ARID1A的突变明显更多（分别为30.8%vs.8.6%，42.3%vs.5.7%），且具有更高水平的TMB 和PD-L1 表达。有研究根据EBV 阳性、MSI、E-cadherin异常和p53的表达确定了5组不同分型胃癌：EBV阳性、错配修复缺陷型（dMMR）、E-cadherin 异常表达、p53 异常表达、p53 正常表达。其中EBV阳性组胃癌与PD-L1高表达显著相关且具有更长的生存期［35］，在ARID1A 表达缺失的胃癌中，MSIH及EBV阳性的比例更高［36］。

3.2 ARID1A与免疫相关生物标志的关系

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，随着肿瘤免疫治疗的发展，多项临床研究显示免疫检查点阻断治疗在胃癌患者上也取得了较显著的效果［37-38］。然而ICIs并不对所有胃癌患者均有效，为了提高免疫检查点阻断治疗的疗效，需要进一步筛选出相关的生物标记物，选择出可以对ICIs产生特异性应答的患者人群。PD-1/PD-L1 抑制剂诱导的肿瘤消退受一些肿瘤微环境相关因素的影响，如PD-L1 表达状态和TILs 数 量［39］。KEYNOTE-059 试 验 中，PD-1 单 抗pembrolizumab 对PD-L1 联 合 阳 性 评分（combined positive score，CPS）≥1 的患者疗效较好［9］。这说明肿瘤微环境相关因素如PD-L1状态和TILs数量可以作为免疫检查点阻断治疗的生物标志。Kim 等［40］研究发现，EBV 阳性和MSI-H 的转移性胃癌经过pembrolizumab 治疗后的总反应率（overall response rate，ORR）分别为100%和85.7%，显著高于其他亚型的胃癌，说明EBV 阳性与MSI-H 也与免疫治疗疗效相关。此外高TMB 的肿瘤对PD-1 抑制剂的应答率较高，是一个强有力的预测肿瘤对免疫检查点阻断反应的指标［41］。这些影响免疫阻断治疗的生物标志间也存在相互的关联，一项对487例晚期胃癌样本的组织分析显示，PD-L1表达阳性与MMR缺陷、EBV阳性以及高密度CD3+和CD8+TILs高度相关［42］。另一项对89例胃印戒细胞癌（signet-ring cell carcinoma，SRCC）样本的研究也发现，CD3+TILs 数量增加与PD-1的表达增加以及MSI状态相关，其中唯一1例EBV阳性的样本，同时也是MSI 型且PD-L1 表达阳性，伴随高度CD3+T细胞浸润［43］。ARID1A突变或表达缺失与这些免疫治疗的预测因子也有着紧密的联系。有研究表明，ARID1A 表达缺失与胃癌患者的高TNM 分期、淋巴管侵犯、血管侵犯、EBV阳性相关，且与较短的OS、较差的预后显著相关，尤其在分化较差的Ⅰ期或Ⅱ期胃癌中与较短的OS 相关［44］。Shen 等［11］研究发现，ARID1A缺失与MMR缺陷及肿瘤MSI状态高度相关，并且可以提高卵巢癌、胃癌等多种肿瘤的TMB 水平。同时，该研究还发现在小鼠移植瘤模型中，患有ARID1A缺失的卵巢癌的小鼠表现出高TMB、较多的TILs 数量以及较高的PD-L1 表达。在胃癌中，ARID1A表达缺失与MSI-H、EBV阳性、PD-L1阳性高度相关，在MSI-H 肿瘤患者中，PD-L1 表达水平在ARID1A缺失肿瘤中显著升高［36］。在机制上，ARID1A可以与MMR 蛋白MSH2 相互作用，在DNA 复制时召集MSH2以发挥MMR功能，因此ARID1A突变或表达缺失与肿瘤MMR功能缺陷相关［11］。在肿瘤细胞中ARID1A 的缺失可以通过激活PI3K/AKT 通路上调PDL1的表达，加入PI3K的抑制剂后，PD-L1的表达明显下降［36］。ARID1A 可以与DNA 损伤检查点激酶ATR的相互作用被招募到DSBs，促进DNA 损伤修复，因此当ARID1A突变或失表达时，DNA损伤修复能力下降，基因组稳定性下降，肿瘤的TMB水平升高［12］。

3.3 ARID1A突变或失表达与ICI治疗疗效的关系

有研究表明，负载ARID1A缺陷型肿瘤的小鼠和对照组相比不仅表现高TMB、较多的TILs 数量以及较高的PD-L1 表达，并且用PD-L1 抗体治疗可以明显降低肿瘤负荷，延长OS，表明ARID1A 缺陷肿瘤对针对PD-1/PD-L1 通路的免疫检查点阻断治疗敏感［11］。另有研究发现，ARID1A突变或失表达可能成为预测抗PD-1/PD-L1 免疫治疗后无进展生存期延长的生物标志，Okamura 等［45］对3 403 例肿瘤患者进行了二代测序后筛选出1 540例ARID1A突变率大于5%的9 种肿瘤患者（其中胃食管癌患者107 例，ARID1A 突变率20%），有ARID1A 突变的肿瘤比ARID1A 野生型肿瘤MSI 的发生率显著增高（20%vs.0.9%，P＜0.001）），其中在胃食管癌中ARID1A突变型与ARID1A 野生型MSI 的比例分别为33%、3.2%（P=0.002）。类似地，ARID1A 突变的肿瘤与ARID1A 野生型肿瘤相比，高TMB（＞20 个突变/mb）的发生率更高（26%vs. 8.4%，P＜0.001），其中在胃食管癌中ARID1A突变型与ARID1A野生型高TMB发生率分别为29%、1.3%（P=0.001）。在375 例接受了抗PD-1/PDL1 免疫治疗的患者中ARID1A 突变的肿瘤患者无进展生存期明显长于野生型肿瘤患者（10.9个月vs.3.9个月，P=0.006），其中胃食管癌中ARID1A 突变型与ARID1A野生型的无进展生存期分别为11.4个月、2.5个月（P=0.21）［45］。以上研究表明，ARID1A 的突变与抗PD-1/PD-L1免疫治疗较好预后相关，可能是检查点阻断治疗敏感性的一个基因标记。

4 结语

综上所述，ARID1A 具有调控细胞周期、介导DNA损伤修复、组织再生等生物学功能，它的突变或表达缺失可以通过多种机制介导肿瘤的发生和发展。同时ARID1A 还与肿瘤的免疫检查点阻断治疗疗效相关，尤其与胃癌的EBV 阳性、高PD-L1 表达、MSI-H、高TMB 及较多的TILs 数量相关，ARID1A 缺失的肿瘤在接受ICIs 治疗后可以获得更好的无进展生存期。这可能使得ARID1A 成为新的免疫治疗的生物标志。随着肿瘤免疫治疗的飞速发展，越来越多的生物标志将会被发现，这更有利于筛选适合免疫阻断治疗的人群，提高免疫治疗的获益，但这些生物标志的可靠性仍需大样本的临床数据验证。