冷冻消融免疫效应的研究进展*

段桦 王丹 连岩岩 周天 胡凯文 综述 姜敏 审校

癌症是全球185 个国家中70 岁以下人群的主要死亡原因，在欧美国家位居第1 位，在中国位居第2位，严重影响全人类健康［1］。越来越多的证据表明，癌症是一种全身性的慢性疾病。绝大多数病例确诊时已处于晚期，能够接受手术切除的病例不足20%，约90%患者死于远处转移。癌症最佳治疗策略应同时兼顾两个方面：局部和全身。一方面实现局部精准打击，减轻瘤负荷；另一方面控制或消灭远处转移灶或潜在转移灶［2］。

冷冻消融术是运用广泛的肿瘤微创手段，局部消瘤作用确切、不良反应小、安全性高。与手术、放疗、热消融相比，冷消融能够最大程度地保留瘤灶抗原活性，从而更有效地激发抗肿瘤免疫反应，甚至诱发“远位效应”，即远处转移灶减小或消失，这对于晚期癌症的治疗极其重要。可见冷冻消融术能够兼顾局部消瘤和全身免疫效应两个方面，且疗效确切、不良反应小。以冷消融术为基础的联合治疗也已广泛用于肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等实体肿瘤。

研究表明远位效应并不常见，而且冷冻消融术还可能导致免疫抑制或免疫无应答，这与癌症类型、坏死/凋亡比例、冷冻参数等有较强的相关性。如何利用、加强全身免疫效应并诱导远位效应是治疗肿瘤尤其是晚期肿瘤的关键。

1 冷冻消融术的免疫效应机制

冷冻消融术借助液氮或低温探头末端快速减压的氩气进行组织冻结，并通过反复冻融循环诱导细胞损伤。已知的4 种抗肿瘤生物学机制包括直接细胞损伤、血管损伤和缺血、细胞凋亡和免疫效应［2］。免疫效应的产生与抗原释放有关。冷冻消融后残余瘤灶的坏死物质持续释放入血，致敏树突状细胞（dendritic cells，DCs），激活T 淋巴细胞，并作为体液免疫的抗原刺激B细胞，从而激活细胞免疫和体液免疫，发挥抗肿瘤免疫效应。

在实际操作过程中，冷冻消融以疗效最大化为出发点，力求根治性消融。冰球边缘（0℃线）必须超出病灶边缘至少1 cm，以使-20℃区域达到整个病灶［3］。已知能够增加细胞损伤的冷冻参数包括快速冻结、缓慢解冻、降低冷冻温度、延长最低温度持续时间以及多次冻融循环［4］。与冷冻消融疗效最大化不同，冷冻免疫效应受癌种、坏死凋亡比例等因素影响，二者对冷冻参数的要求有出入，前者着眼于局部消瘤效果，后者着眼于全身和瘤内免疫状态的变化，是局部和全身的概念，如何平衡好二者的关系值得深入研究。

2 冷冻消融术在不同癌种中的免疫效应

冷冻免疫现象最早发现于20 世纪60年代，Yantorno 首次发现冷冻兔精囊腺后体内产生特异性抗体［5］。随后Soanes观察到1例前列腺癌肺转移患者接受冷冻治疗后原发灶和肺转移灶均消失，另1例前列腺癌颈椎转移患者冷冻后颈椎转移灶消失。冷冻免疫反应的概念，指的是冷冻消融后肿瘤组织坏死并释放抗原，从而刺激免疫系统产生抗肿瘤免疫反应，达到清除残留癌细胞的目的［5］。研究表明，不同癌种对于冷冻治疗的免疫应答不完全相同，这与肿瘤异质性有很大关系［4-5］。

2.1 前列腺癌

最早的冷冻免疫现象即来自前列腺癌。目前冷冻消融术可用于Ⅰ期以及放疗后局部复发性前列腺癌的抢救性治疗。基础研究方面，Yang等［6］建立小鼠前列腺癌双侧腹股沟移植模型，干预右侧肿瘤后观察左侧肿瘤生长和肺转移情况。结果与手术组和对照组相比，冷冻组小鼠的肿瘤生长抑制最明显，生存期最长，肺转移率也最低。同时CD4+T、CD8+T、Th1/Th2 比值、细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和NK细胞的杀伤活性增强，证实冷冻消融能够通过激发免疫效应发挥远位效应。

但并非所有研究都得到阳性结果，Hoffmann等［7］冷冻前列腺癌大鼠后进行癌细胞复接种，尽管在血清中发现了特异性抗体，但对肿瘤的继发性生长无明显影响，其认为冷冻效果可能仅局限于细胞和血管层面的变化，如何将冷消融免疫效应放大、并转化为生存获益需要更多的研究来证实。

2.2 肾癌

冷冻消融在肾癌中的免疫效应较明显。欧洲泌尿外科协会推荐冷消融治疗直径＜4 cm、T1a 期尤其是高龄或不能耐受手术的肾癌。Kato 等［8］证实冷冻消融可以引起肿瘤组织和全身的免疫反应。研究收集22例肾癌患者冷冻消融前和冷冻消融后3个月的肿瘤组织和14 例患者的血液标本，发现消融后肿瘤组织中抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）浸润增多，T 细胞发生克隆性增殖。冷冻后组织内CD4+、CD8+、颗粒酶A、CD11c 的转录水平显著升高，CD8+/FOXP3 比值明显升高，可见冷冻消融通过抗肿瘤T细胞的寡克隆扩增，诱导强烈的免疫反应。

Matin 等［9］研究发现，无论是正常组织还是肿瘤组织，冷冻消融的物理属性都能诱发免疫炎症反应，使免疫抑制状态得以缓解或逆转。在小鼠肾癌模型中，荷瘤组小鼠未见明显的淋巴细胞浸润，而冷冻正常小鼠肾脏组和冷冻荷瘤小鼠肾脏组都可见明显的炎症反应。浸润细胞主要为中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+、CD8+T，IFN-γ的表达也增加。

2.3 乳腺癌

冷冻消融术是治疗单灶性导管癌的有效方法，即使是Ⅳ期乳腺癌，冷冻消融术也是一种安全有效的方法［10］。一项乳腺癌冷冻免疫的研究来自Sabel［11］。在小鼠MT-901乳腺癌模型中，与手术组相比，冷冻组Th1型细胞因子（IL-12、IFN-γ）明显升高，Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）无明显变化。肿瘤引流淋巴结内特异性T淋巴细胞增多，脾脏NK细胞活性增加。干预2周后小鼠左侧皮下再次接种MT-901细胞株，结果手术组肿瘤再发生率为86%，冷冻组仅为16%。在冷冻组小鼠左侧皮下接种RENCA肾癌细胞系后，约80%出现新发肿瘤，可见冷消融不仅能够激活免疫效应发挥肿瘤抑制作用，而且具有高度特异性。

2.4 肺癌

尽管还没有随机对照试验证实经皮冷消融术与手术治疗早期肺癌的疗效差异，但是冷消融治疗已经被认为是治疗ⅠA期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的可行选择。体外实验表明，肺癌细胞经冷冻处理后能够激活单个核细胞［12］，并作为肿瘤抗原致敏DC 诱导CTL，发挥靶细胞杀伤作用［13］。在NSCLC的临床研究中，宋光等［14］研究发现，氩氦冷冻后CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+、IFN-γ 均显著增多，CD8+T、IL-6显著降低，表明氩氦刀能够改善肺癌患者的免疫状态，发挥抗肿瘤免疫效应。

2.5 肝癌

有研究认为，与射频消融或微波消融相比，肝脏肿瘤冷冻消融的意义有限，因此研究相对较少［14］。现有的研究结果也具有一定争议。20 世纪70年代，有研究认为与手术组相比，冷冻消融组并未发现明显的免疫应答现象［15］。但在后续的研究中，Osada等［16］发现接受冷冻治疗的13 例肝癌患者中，有5 例患者出现冷冻免疫反应，外周血IFN-γ/IL4 比值升高。李前进等［17］观察到冷消融后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及NK细胞活性较术前明显升高，但CD8+细胞活性较术前明显下降。

2.6 胶质瘤

胶质瘤是最早使用冷冻消融治疗的肿瘤之一，疗效明确，能够产生抗肿瘤免疫效应。Yin等［18］研究发现氩氦刀冷冻后DC 表面的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80/CD86等标记物明显上调。He等［19］将发现荷瘤组小鼠的肿瘤引流区淋巴结中存在免疫耐受型DC，而与手术组相比，氩氦刀能明显恢复免疫耐受DC的功能，并触发T细胞诱导产生抗肿瘤免疫。

2.7 黑色素瘤

与其他肿瘤不同，研究表明冷冻消融在黑色素瘤可能发挥负向免疫调节作用。Kudo-Saito 等［20］建立小鼠黑色素瘤模型，发现冷冻后瘤内、脾脏、骨髓中活化白细胞黏附分子（activated leukocyte adhesion molecules，ALCAM）表达均明显增加，ALCAM 阳性细胞通过抑制IFN-γ 产生以及减弱肿瘤特异性CD8+T细胞毒性而发挥负向免疫调控作用。当ALCAM 被单克隆抗体封闭后，CD8+T 的细胞毒性明显增加，肿瘤生长和转移明显变慢，因此ALCAM 表达增加可能是免疫抑制的分子机制之一。但最新研究表明当将冷冻消融与胞嘧啶鸟苷联合时能够显著增加肿瘤特异性CD8+T细胞数量，并产生更多干扰素γ［21］。

2.8 肉瘤

多数研究都表明，冷冻消融术在纤维肉瘤中也主要发挥免疫抑制作用。Yamashita等［22］发现与手术相比，冷冻组大鼠抗肿瘤免疫功能明显滞后。将冷冻组大鼠的残余肿瘤组织切除后，肿瘤转移明显减少，而将冷冻后坏死肿瘤组织移植到手术组大鼠体内，则肿瘤转移明显增加。可见冷冻消融不仅导致免疫功能抑制，并能促进肿瘤转移。Sabel等［23］也发现，冷冻消融后小鼠对继发性肿瘤的抵抗力明显降低，继发性肿瘤的生长和转移率增加。Shibata等［24］发现，冷冻消融能够加速纤维肉瘤模型小鼠的肺转移，且对再种植的肿瘤无抑制生长作用，并认为冷冻后免疫抑制可能由调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）引起。

在其他类型肉瘤中，冷冻消融的免疫学效应似乎更好一些。如Kawano 等［25］建立小鼠骨肉瘤模型，将冷冻后肿瘤组织与DC 体外共培养后移植到小鼠体内，小鼠血清干扰素水平升高，肺转移灶减少，转移灶中CD8+T淋巴细胞数量增加，说明冷冻后肿瘤组织致敏了DC，从而使得抗肿瘤免疫应答能力明显增强。此外，在肌肉瘤和癌肉瘤的研究中也能检测到冷冻手术引发的免疫效应［26］。

可见冷冻消融术在不同癌种间，甚至是同一癌种的不同研究中发挥的免疫效应是不同的，说明冷冻免疫效应与肿瘤异质性密切相关。此外，免疫效应还受到多种因素干扰，如坏死/凋亡比例、冷冻参数等，下面对研究已经发现的影响因素做出介绍。

3 冷冻消融术免疫效应的其他影响因素

3.1 坏死、凋亡面积比例

冷冻消融后导致的细胞坏死或凋亡可引起完全不同的抗肿瘤免疫效应，因此组织坏死与凋亡面积的比例是决定免疫状态的关键因素［27］。有研究认为，细胞坏死后内容物仍在，并能分泌DNA、RNA、热休克蛋白（heat shock protein，HSP）等危险信号，这些危险信号具有免疫刺激作用，能够致敏DC以充分激活T细胞，从而导致特异性免疫反应［28］。但细胞凋亡后其碎片被巨噬细胞或DC 吞噬，并不释放DNA、RNA和HSP等危险信号，无法激活DC。未成熟的DC可能触发免疫抑制信号，从而导致T细胞失活［29］。

由于冰球内的温度降低速度不同，肿瘤中心区表现为凝固性坏死，周围区域则表现为凋亡。因此在冷冻治疗过程中，增加坏死面积、减少凋亡面积是免疫最大化的重要因素。

3.2 冷冻范围

现代冷冻理论强调完全性消融，冰球边缘要超出病灶边缘1 cm，但研究表明不同消融范围的免疫学效应差异很大。Sabel等［23］建立小鼠MRMT-1肝癌模型，发现不完全冷冻组小鼠存活时间明显长于对照组，而完全冷冻组生存时间未延长，并有3例死亡。与对照组相比，完全冷冻组小鼠对再次接种更敏感，而不完全冷冻组小鼠则能明显抑制再次接种肿瘤的生长，可见冷冻范围可能是调节免疫反应的关键。

另一项研究的结果与之类似。Urano等［30］建立小鼠结肠癌肝转移瘤模型，分为对照组（冷冻正常肝组织）、小体积冷冻组（冷冻1个病灶）、大体积冷冻组（冷冻3个病灶），结果发现小体积冷冻组癌结节数量最少，并显著低于对照组和大体积冷冻组。脾脏转移方面，依然是小体积组最低（134.7±28.1），而对照组（158.2±25.3）和大体积组（156.3±9.4）基本相当。提示较少数量的冷冻可能更有利于控制肿瘤转移，冷冻数量太多反而发挥负向作用。有研究认为，当大量肿瘤被冷冻时，产生大量免疫复合物反而可能导致“高区域耐受性”，即抗原超载可能导致免疫抑制［31］。

3.3 冷冻速度

研究表明，不同冷冻速率的免疫效应差异明显［31］。Sabel 等［32］建立转移性乳腺癌小鼠模型，发现与手术切除相比，高冷冻速率可显著增加肿瘤引流区淋巴结（tumor draining lymph nodes，TDLN）中肿瘤特异性T细胞数量，减少肺转移，提高生存率。然而，低冷冻速率组中Treg细胞增加，肺转移增加，生存率明显降低。推测其原因可能为高冷冻速率导致细胞以坏死为主，从而激活免疫反应，而低冷冻速率则导致细胞以凋亡为主，从而出现免疫抑制。

3.4 冷冻循环次数

目前，主流的冷冻循环次数为2 次，研究认为能够达到最佳消融效果，尽管消融最佳参数和免疫最佳参数并不完全一样，但研究发现2次循环也能达到最佳免疫效应。Takahashi 等［33］建立小鼠肺癌、黑色素瘤双侧种植模型，进行左侧肿瘤冷冻，测量对侧肿瘤体积，并按照1、2、3 次循环次数分组，发现2 次循环组肿瘤生长速度最慢，瘤周CD4+T和CD8+T细胞浸润比例最高。2 次循环组小鼠存活率也最高，与1 次组有统计学差异，但与3次组无统计学差异。此外，2次循环组瘤周灌洗液中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12β、IFN-γ、TNF-α 最高，可见2 次循环可能是最佳参数，能最有效激活抗肿瘤免疫细胞，增加促炎细胞因子分泌，有效抑制肿瘤生长。

3.5 不同时间节点

有学者认为，冷消融导致的免疫效应与时间有很强的相关性。Si［34］等纳入20 例前列腺癌患者，发现术后4 周外周血TNF-α 和IFN-γ、Th1/Th2 比值均明显升高，但术后8 周时明显下降，提示冷冻消融的免疫增强效应不具备持久性。Misao［35］等建立小鼠乳腺癌模型，发现干预后1～3 周内手术组再种植抑制率较高，但在此后至10周内，冷冻消融组明显高于手术组（80%vs. 18%），且局部淋巴结转移明显降低。可见免疫抑制和免疫增强可能存在一定时间差。

4 冷冻消融术免疫效应增强策略

尽管与其他治疗方法相比，冷消融具有最佳免疫效应，并能引起远位效应，但不幸的是，这种效应很少发生，因此如何增强冷消融的免疫效应是实现远位效应、治疗晚期肿瘤的关键。肿瘤免疫疗法的实质是激活免疫系统，冷冻消融可以作为体内疫苗接种工具来加强免疫疗法的影响。初步研究证实当冷冻消融与免疫调节疗法结合时，这种效应可能会增强［36］。

4.1 增加坏死面积，减小凋亡面积

坏死诱导免疫增强，凋亡导致免疫抑制，坏死、凋亡之间的平衡是调控免疫效应的关键因素。最近的研究集中在两种方法上，一是借助计算机模型绘制等温线，进行术中冰球的温度实时监测，将冰冻区域进行可视化成像，以此预估达到-40℃以下的肿瘤体积，从而在消融过程中形成实时反馈［37］；二是借助分子佐剂来增加冰球外围组织的冷冻敏感性，包括盐、防冻蛋白和一些氨基酸等［38］。由于冰晶的存在，这些佐剂会造成额外的直接细胞损伤。但如何选择合适的剂量，在保证起效的同时不造成周围正常组织的损伤，仍存在技术瓶颈。

4.2 细胞过继疗法

经典的细胞过继疗法（adoptive cell therapies，ACTs）指从患者的肿瘤或外周血中分离免疫细胞，进行体外扩增后重新输注回体内，以达到根除肿瘤的目的。目前，ACT主要用于T细胞、NK细胞和单核细胞来源的DC［39］。一项冷冻联合同种异体NK 细胞免疫治疗晚期肝癌的研究表明［38］，联合组中位无进展生存期明显高于单纯冷消融组（9.1 个月vs. 7.6 个月），应答率和疾病控制率也均优于单纯冷冻组。免疫状态方面，联合组患者NK细胞、Th1型因子水平明显升高，Th2型因子无明显变化。在晚期肾细胞癌和晚期NSCLC中也观察到同样的现象［41-42］。

4.3 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）可以刺激DC表达肿瘤抗原，已广泛用于癌症免疫治疗，与冷冻消融联合可增强抗肿瘤作用。一项纳入6例晚期肾癌患者的临床研究表明［43］，冷冻消融干预肺转移灶联合GMCSF雾化吸入能够诱导全身性细胞和体液免疫。在4例患者中观察到肿瘤特异性CTL增殖和Th1细胞因子增多。而且临床应答似乎与免疫反应大小有关。在晚期激素难治性前列腺癌患者中也发现外周血单核细胞肿瘤特异性T细胞反应增加。在小鼠皮下胶质瘤模型中，脾脏分泌IFN-γ增加，CD8+T细胞杀伤作用显著增强，并在第7天达到高峰［44］。

4.4 免疫检查点抑制剂

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）是最经典的免疫检查位点，主要表达在T细胞上。研究证实冷冻消融和免疫治疗的联合治疗可能有利于增强免疫检查点抑制剂的效果［45］。

伊匹单抗（ipilimumab）是CTLA-4 检查点抑制剂，一项临床研究将早期可手术乳腺癌患者分为3组，分别于术前接受单纯冷冻消融、ipilimumab 以及二者联合治疗，观察免疫状态变化和对手术延迟的影响。研究发现3种治疗模式都不会造成手术延迟，并且联合治疗组可能具有更好的瘤内和全身免疫效果，联合治疗与Th1 型细胞因子、CD4+和CD8+T 细胞的活化与增殖以及治疗后肿瘤内效应T 细胞与Treg细胞比值的持续升高有关［45］。在另一项临床研究中，11 例肝细胞癌患者接受CTLA-4 抑制剂tremlimumab 联合冷冻消融治疗后，肿瘤组织中CD8+T 细胞出现积聚［46］。在小鼠前列腺癌模型中，联合组小鼠不仅肿瘤明显缩小，病灶内CD4+、CD8+T 细胞出现高度浸润，瘤内效应T细胞与调Treg的比值也显著升高［47］。

目前，关于免疫检查点抑制剂无效的一种机制是肿瘤内特异性T 细胞浸润不足。而冷冻消融能够引起瘤内免疫状态的变化，有利于加强免疫检查点抑制剂效应，二者具有协同增效的理论基础和试验支持，但如何进行组合尚没有定论，是下一步的研究方向［48］。

5 Toll样受体激动剂

先天性免疫细胞表达Toll 样受体激动剂（Tolllike receptor，TLR），TLR信号能够触发巨噬细胞和树突状细胞的代谢转变，促进从免疫耐受向免疫激活状态的转换，诱导IFN-γ 和炎症介质的产生，从而实现T细胞免疫反应［49-50］。

咪喹莫特是一种Toll 样受体激动剂，Nomikos等［51］将其与冷冻消融联合治疗56 例基底细胞癌患者，发现CD3+细胞密度在治疗后第12～16 天明显升高。CD68+细胞密度也持续升高并保持在较高水平。而冷冻治疗后Treg 细胞数量明显下降，并持续到治疗周期的第28天，可见免疫状态发生明显变化，联合治疗增强了免疫效应。

6 结语与展望

冷冻消融技术进入中国已20年，无论是单独运用，亦或是联合其他治疗，在不同分期的多个癌种中发挥着重要作用。除具有明确的局部抗肿瘤作用外，大多数研究均表明冷冻消融能够激发全身或瘤内的免疫反应，甚至诱导远处病灶消失。但也有部分实验表明存在免疫无应答或免疫抑制的情况。这与癌症类型、坏死凋亡面积比例、冷冻参数如范围、速率、数量等有关，因此应明确最佳冷冻免疫参数极其重要，是冷冻消融抗肿瘤作用的进一步延伸。