慢性伤口细菌生物膜的研究进展

程海涛，黄桂玲

（1.长江大学医学院，湖北430000；2.武汉大学中南医院）

慢性伤口是指经过临床治疗6 个月后，完全没有愈合迹象的伤口。压疮、糖尿病足溃疡、动静脉溃疡、创伤性溃疡、肿瘤伤口等是慢性伤口的典型代表[1],目前临床上常采用的手段主要有手术清创、自溶性清创，同时辅以局部负压真空吸引、高压氧等治疗[2]。2014版临床实践指南提出：细菌生物膜（BBF）的评估和治疗是慢性伤口研究领域的最新前沿。其作为细菌、细胞分泌的产物和分泌的细胞外基质以及坏死的碎片等混合成的一种膜性组织[3]，对慢性伤口治疗以及护理具有重要影响。现将慢性伤口的细菌生物膜形成机制、特点、去除方法以及慢性伤口愈合过程中参与的相关因子综述如下。

1 细菌生物膜形成机制

细菌生物膜形成机制主要包括3 方面：①在严重营养不良、超低酸碱度（pH）以及极高渗透压因素下，浮游细菌通过黏附因子黏附在创面[4]。②抗生素滥用导致耐药细菌大量繁殖扩张，形成生物膜[5]。③群体感应(QS)机制，包括QS 分子作用和对上皮细胞的刺激。QS 分子方面，QS 分子诱导机体感染的中性粒细胞或者巨噬细胞凋亡，以凋亡细胞为食，通过中性粒细胞或者巨噬细胞凋亡后的氧化酶和降解酶破坏机体，造成生物膜中的细菌大面积扩散，铜绿假单胞菌的高丝氨酸内酯信号分子（AHL）和假单胞菌喹诺酮信号（PQS）对巨噬细胞激活作用下降，机体免疫向Th2 型发展，导致创面炎症状态不能转归，伤口迁延不愈[6]。上皮细胞的刺激作用方面，金黄色葡萄球菌生物膜会导致上皮角化细胞凋亡并限制其生长。α-毒素作为金黄色葡萄球菌形成生物膜的关键物质，会通过对上皮角化细胞的诱导，导致细胞毒性反应，最终迫使其凋亡。一般情况下，当感染伤口只有浮游菌时，角化细胞首先会细菌内化，然后会迫使其凋亡，而在生物膜中，不需要经历内化过程，而是可以直接诱导其凋亡，这就会造成细菌大面积繁殖，覆盖慢性伤口表面，最终延迟伤口愈合。生物膜组成成分能够限制中性粒细胞趋化和分泌，并且会迫使成纤维细胞提前衰老，从而降低机体免疫功能以及阻碍成纤维细胞重建最终导致伤口不愈合。可见，造成创面不愈合的机制是在特殊细菌的细胞学基础之上的相对性的研究机制，主要细菌是铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；主要参与细胞是中性粒细胞以及巨噬细胞、上皮角化细胞以及成纤维细胞。

2 慢性伤口细菌生物膜的特点

①细菌生物膜广泛存在于慢性伤口，且不宜检出。慢性伤口必然有细菌黏附，开放性伤口2 d 不清创，皮肤周围的细菌就会导致创面污染[7]，加之其以生物膜作为天然“避风港”，以往检测不能突破生物膜屏障，导致感染细菌的种类很难被检测出。为此，越来越多的研究人员开始探索、使用新颖、高效的检测手段，如聚合酶链式反应（PCR）、激光共聚焦扫描技术（CLSM）、荧光原位杂交技术（FISH）以及分子检测技术等[8]。②细菌生物膜难以被清除，再生能力很强。其原因主要是：其一，细菌以附着于伤口表面为生，并以创面为营养来源；其二，细菌通过与细胞外基质混合、处于休眠状态的方式形成抵抗抗菌药物作用的防御屏障，致使普通抗菌药物不能有效杀灭细菌[9-10]。

3 慢性伤口细菌生物膜去除方法

3.1 物理机械清创方法 有效清除细菌生物膜的第1 步是彻底、有效的手术清创[11]，即用手术刀清除异物和愈合不良组织，暴露干净创面，切除已经失活的组织、腐肉以及坏死组织，甚至一些窦道，让伤口彻底变为新鲜伤口，保留组织活性[12]。清创不及时以及细菌生物膜残留都会引起多菌种细菌定植，导致二次感染，影响愈合[13]。水刀（超声雾化水流技术）的核心技术是液体喷射，高速雾化水流可快速清除细菌生物膜，创面环境湿润洁净，病人感受良好，属于无痛清创。Caputo等[14]采用水刀无痛清创对溃疡病人实施治疗，结果显示：超声雾化水流技术高效、安全、操作简单、快速，其与手术清创比较，清创花费时间较短，手术速度较快，并且耗材量较少，舒适度较好。

3.2 封闭负压引流技术 程海涛等[15]对于慢性伤口的治疗方法进行研究，结果显示：封闭负压引流技术联合湿性愈合与常规换药以及传统湿性愈合比较，病人伤口愈合比例较高，创面修复较快，渗液pH 值较低，换药次数及医疗花费较少。原因可能是封闭的湿润环境适合伤口愈合，也利于肉芽组织生长；同时，在封闭环境下及早运用封闭负压引流，可以保持创面清洁，避免细菌感染；此外，负压状态下及时进行流水冲洗和抽吸，可以及时清除伤口渗出液及坏死组织，细菌繁殖失去有利条件，有利于伤口快速愈合。封闭负压引流技术一方面为慢性伤口治疗提供了有效选择，另一方面也存在一定弊端，如可能导致肉芽组织过度增生，病人瘢痕情况较明显。随着医疗水平不断提高以及材料学发展，封闭负压引流技术逐渐被应用于大部分急诊创伤以及部分难愈性伤口，在复杂的环境下，医务人员还应进行针对性的抗感染治疗，注意不能过度使用抗感染药物，以防发生耐药性风险。

3.3 化学药物预防

3.3.1 抗生素 不恰当的使用抗生素会促使细菌生物膜形成[16]；同时，慢性伤口细菌生物膜形成后，其对抗菌药物的防渗透会限制抗菌药物与细菌大面积接触，从而使药效只能发挥65%～70%，造成细菌耐药性提高上千倍[17]。故临床治疗感染时应综合考虑以选择最优抗生素。清除生物膜作用效果较好的抗生素分别是氟喹诺酮类、亚胺培南；对细菌细胞外多糖基质渗透较好的是大环内酯类、氟喹诺酮类和β-内酰胺类、头孢他啶、氨基糖甙类[18]。多菌种导致的细菌生物膜治疗方案以联合用药为主，如头孢类用药搭配克拉霉素可直接破坏细菌生物膜，用药3 d 后可杀死金黄色葡萄球菌，预防感染[19]。

3.3.2 含银敷料 含银敷料是去除细菌生物膜，促进慢性伤口愈合过程中首推的广谱抗菌敷料，高浓度银离子敷料（5～10 g/mL)作用于伤口1～2 d，细菌生物膜内的细菌会被基本杀死[20]，可能是由于银离子不仅可以将细菌和氧气、养分隔绝，阻止代谢毒素释放，还可以局部抗感染，降低创面中细菌的扩展水平，加速伤口愈合[21]。含银敷料材质具有弹性，故有效固定于创面尤为重要。

3.3.3 碘 碘可以有效杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，但其直接作用于伤口会有细胞毒性且可能造成病人不舒适[22]。

3.4 生物疗法 蛆虫疗法(MDT)是在伤口处放无菌医用蛆虫，利用其生物功能，消化、吸收坏死组织碎片和腐肉，从而去除细菌赖以生存的基床，抢夺细菌营养源，减缓细菌繁殖速度，减轻炎症反应，进而使伤口通过自身免疫愈合[23]。蛆虫只消化、吸收腐肉，对正常细胞无危害；同时，它还可以爬至伤口深部窦道蚕食细菌生物膜最易形成的部位；此外，蛆虫可分泌多种蛋白酶以及抗菌酞，分泌物能将腐肉分解成半液状，加快蛆虫第2 轮蚕食，最终杀灭、降解细菌[24]。极具创意的蛆虫清除生物膜的方案，必须深挖其机制研究，以更好地指导临床[25]。

3.5 其他 2000 多年前蜂蜜就开始用于覆盖、治疗溃烂伤口，研究显示：蜂蜜可杀死大部分细菌，如革兰阳性菌、革兰阴性菌、需氧菌、厌氧菌等，其疗效显著，愈合速度较快[26]。无菌蜂蜜去除细菌生物膜可能是由于其高糖、高渗透力可以直接突破生物膜屏障[27]。值得注意的是，蜂蜜可以灭菌，并不意味着任何蜜蜂采的蜂蜜效果均显著，一般深山地区较好，这可能与所采蜜内含有植物素有关。随着医学研究的不断深入，植物素灭菌也成为人们关注的焦点[28]。

4 慢性伤口愈合过程中涉及的因子

慢性伤口细菌生物膜被去除后，各种炎性因子会在伤口处呈现高表达，免疫应答一旦被激活，创面即可快速愈合。

4.1 Toll 受体（TLR） TLR 作为对抗抗原和自身异常的候选基因[29]，可以快速识别病原体相关分子模式(PAMPs)[30]，其高表达可快速识别细菌感染，激活天然免疫反应，促进伤口愈合。其中，TLR 家族中的TLR2专门识别革兰阳性菌成分和细菌脂蛋白脂胞壁酸，其与TLR6 混合共同识别革兰阴性菌成分、酵母多糖、肽聚糖、支原体脂蛋白；TLR4 是机体对脂多糖(Lipopolysaccharide-LPS)应答(革兰阴性菌)的关键受体[31-32]。此外，TLR 高表达也可激活核转录因子NF-κB[33]，刺激与免疫相关的因子，引起明显的炎症反应，尤其是肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)促炎细胞因子是炎症反应表达最高的因子。

4.2 巨噬细胞移动抑制因子(MIF) MIF 是炎症介质，被各种系统和组织中的细胞广泛表达。丘脑-垂体轴调节MIF 分泌，糖皮质激素也可控制其释放水平以及合成数量[34]。研究表明：MIF 是促炎因子，是先天免疫和后天免疫的重要调节因子，其可以通过促进炎症因子产生和负性调节糖皮质激素的抗炎作用来影响机体免疫反应[35]。MIF 分泌增加可诱导巨噬细胞分泌其他促炎因子，并以自分泌和旁分泌方式激活T 淋巴细胞，从而加剧炎症反应；同时，MIF 也可抑制与糖皮质激素相关的抗炎和免疫反应，进而加重炎症反应。

4.3 血管内皮生长因子(VEGF) VEGF 是一种可调节生成新生血管的糖基化分泌性多肽[36]，主要功能是促进内皮细胞增生、趋化细胞移动以及增加血管通透性、诱导血浆蛋白溶酶原激活物和血浆溶酶原激活抑制剂-1 等从而改变细胞外基质，使其更易于血管生长，其活性较强、专属性较高，在促进内皮细胞增殖、分裂和运动的同时，可增加血管通透性[37]。临床可通过检测VEGF 在创面的表达情况判断创面愈合状况，VEGF 转录和分泌在部分和全层皮肤伤口中提高，则说明创面正在愈合[38]。

4.4 表皮细胞生长因子（EGF） EGF 可通过信号传导引起细胞内生化反应，启停细胞分裂相关基因，使静止细胞快速进入细胞分裂期，以达到细胞增殖的目的。首先，EGF 作为一种生长因子，具有对炎性细胞以及成纤维细胞和表皮细胞的选择性以及迫使其趋向聚集的作用，它可以提高细胞迁移数量，迫使细胞朝创伤部位移动。其次，EGF 作为有丝分裂刺激源，可以加速细胞分裂，促进细胞增殖[39]。再次，EGF 还可以刺激细胞间质快速合成，刺激血管快速生成，促使肉芽组织爬生，最终使创伤达到修复、愈合的状态[40]。从机制来看，一方面，EGF 作为皮肤自带物质，通过多种、多层次磷酸化，可以实现细胞营养物质增加的目的；另一方面，EGF 可通过活化糖酵解作用增强呼吸代谢频率，它可激活磷酸果糖激酶，激活核糖核酸（RNA）转录，促进蛋白质与脱氧核糖核酸（DNA）的合成，最终使表皮细胞增殖分化[41]。

4.5 成纤维细胞生长因子2（FGF2） FGF2 是多功能细胞生长因子，可以促进细胞间有关基质蛋白的表达，促进内皮细胞[42-43]、成纤维细胞的DNA 合成以及细胞分化、增殖，还可以重建新毛细血管结构，加速伤口愈合[44-45]。同时，FGF2 也能增强炎性细胞杀菌能力，利于伤口的全面修复[46]。此外，FGF2 还可避免瘢痕形成。研究表明：创面愈合初期成纤维细胞数量会急剧增加，但随着成纤维细胞达到峰值，FGF2 在伤口中的表达降低，敏感度下降，肉芽组织生长减慢[47]，过多的胶原降解，瘢痕形成减少。

5 小结

去除细菌生物膜是慢性伤口治疗、护理研究领域的重要内容，本研究从细菌生物膜形成机制、特点、去除方法以及生物膜去除后伤口相关因子表达方面进行综述，旨在为制定慢性伤口治疗方案提供科学的理论依据。但本研究只介绍了目前使用频率较多的与细菌生物膜相关的慢性伤口治疗方案，基于临床实践的经验成果纳入不足，研究者在以后研究中还需进一步扩大研究范围，深化研究内容。