成血管-成骨耦联相关因子、细胞在骨中作用机制的研究进展

申震 姜自伟 陈国茜 李定 张严 李紫阁 黄枫

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第一附属医院骨伤科，广东 广州 510405

骨是一种高度血管化的组织，在整个机体生命周期中经历着持续的吸收和重建过程，而在此过程中血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)和骨细胞之间在空间和时间上密切连接以保持骨骼的完整性[1]。血管生成是各类器官发生中最早的事件之一[2]，骨血管系统在骨骼发育、重塑以及维持骨量平衡中均起着重要作用[3-8]。在骨生长发育和修复期间，新血管生成是重要的环节，二者都涉及血管生成和骨生成信号途径之间的激活和复杂的相互作用，而血管生成发生在骨生成之前[9]，且新生血管可确保循环成骨细胞前体和破骨细胞转运至特定部位[10]。这说明骨生成是一个血管依赖性过程，血管生成与骨生成空间和时间上密切的关系被称为“成血管-成骨耦联”作用[3,11-12]。近年来随着科学技术的发展，研究发现骨内微小血管生成和骨内微环境在成骨和骨量维持等方面同样扮演着重要角色[13]。据报道[14]，骨内还存在两种具有不同形态、功能和空间分布的特异性血管ECs亚型，即对血小板内皮细胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31/PECAM-1)和内皮粘蛋白(endomucin，Emcn)高表达的H型ECs(CD31hiEmcnhi)以及对CD31和Emcn低表达的L型ECs(CD31loEmcnlo)。其中H型ECs在介导血管生成和骨生成耦联过程中起着重要作用，H型血管不仅可向骨组织供应营养物质、生长因子、激素、趋化因子和细胞因子以及传输代谢废物，还充当了骨骼和邻近组织之间的交流网络[15]，由H型血管释放的血管分泌因子传递信号调控着骨生长和骨稳态，并进一步增强血管生成和骨生成间的相互联系[14，16]。这不仅丰富了血管与骨相互作用间的内容，还为探究成血管-成骨耦联机制提供了新的研究方向。故本文就成血管-成骨耦联相关因子、细胞及机制在骨中所起的作用进行综述。

1 成血管-成骨耦联调节因子

1.1 血管内皮生长因子

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前研究最多且是已知的诱导血管生成最强的一种细胞因子，是促进血管生成相关的分子和细胞级联反应中的关键调节剂[17]。虽然VEGF主要作用于ECs，但也可与成骨细胞等其他类型细胞上的VEGF受体相结合[18-19]，最终通过血管发生、血管生成或淋巴管系统形成等形式促进血管系统的发育[20-21]。然而，VEGF不仅对血管生成具有重要作用，在骨生长发育过程中同样扮演重要角色[22-23]。一方面VEGF自身就具有促进成骨的能力，既能调节成骨细胞的趋化性、增殖和分化，调控成骨细胞的活性从而对成骨产生直接作用[24]；另一方面又能调节间充质细胞向成骨细胞分化，或通过血管生长机制刺激ECs产生成骨细胞因子，促进祖细胞向成骨细胞分化而发挥间接作用[25]。Geiger等[24]发现处于生长阶段长骨中的血管尚未完全形成之前均能检测到VEGF的表达，并且该表达与骨生成过程有关。与此同时，VEGF还具有趋化作用可使骨髓间充质干细胞向骨缺损区域富集，通过促进血管生成、软骨吸收以及软骨内成骨的分化来促进新骨生成。而当抑制VEGF表达或VEGF表达降低时，则会导致成骨障碍或骨量丢失。VEGF及其相关血管对骨生成发挥重要作用，但血管网络的生长又受成骨细胞所提供的信号调控[14]。VEGF通过直接或间接作用于成骨细胞促进骨的生长发育，而成骨细胞又能分泌VEGF等因子反作用调控血管生成[26]。Huang等[27]在小鼠及体外细胞实验中证实了成骨细胞尚能分泌趋化因子Cxcl-9(C-X-C motif ligand- 9)调节血管生成，Cxcl-9能与VEGF相互作用并阻止其与VEGF受体结合，继而阻止VEGF与ECs和成骨细胞结合，从而抑制血管生成和骨生成。因此，减少骨内 Cxcl-9 含量，增加骨内血管生成，从而为骨生成和再生提供了新的作用靶点。而VEGF与成骨细胞间的相关作用也正是成血管-成骨耦联作用的一种体现。

1.2 血小板衍生生长因子-BB

血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)在骨生成过程中由脱颗粒化血小板释放。据报道[28]，PDGF-BB既能通过上调VEGF而刺激血管生成，又可通过对成骨细胞施加趋化性和促有丝分裂信号促进成骨。Xie等[29]在研究中发现位于骨膜处的破骨前体细胞可分泌PDGF-BB，一方面PDGF-BB可刺激内皮祖细胞和MSCs的迁移，并促进血管生成[30]。另一方面PDGF-BB被认为是能够调动间充质来源细胞，稳定新生血管并协调成骨细胞分化的细胞成分[31]。除此之外，PDGF-BB可诱导H型血管生成以促进血管生成与骨生成之间的耦联作用[29]。研究发现，在骨膜骨中PDGF-BB诱导H型血管生成并刺激1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1 phosphoric acid，S1P)分泌以促进成骨细胞分化，继而促进新骨生成；在骨小梁重塑过程中，PDGF-BB同样诱导生成H型血管，但在骨重塑期间主要发挥物质传输作用。

1.3 转化生长因子-β

转化生长因子-β(transforming growth factor -β，TGF-β)是一种多效能生长因子，具有促进细胞增殖、调节细胞分化、调控细胞周期及诱导细胞凋亡等作用，同时可刺激细胞外基质分泌与沉积，在骨生成与血管生成方面扮演重要角色[32]。Tang等[33]首先证实了TGF-β是一种重要的趋化募集因子，参与MSCs的募集和增殖，不仅可调节成骨细胞分化，还可促进成骨细胞前体向骨重塑部位转移。与此同时，TGF-β促进成骨细胞的新陈代谢和细胞外基质的合成，通过抑制破骨细胞的生成和成熟破骨细胞的活性，实现抑制骨吸收和促进成骨的目的。除了在成骨方面的重要作用，TGF-β还可调节造血细胞和血管ECs中VEGF的表达，从而在成骨过程中对血管化进程产生积极影响，继而加强血管生成与骨生成之间的耦联关系[34]。

1.4 低氧诱导转录因子-1α

低氧诱导转录因子-1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)是成血管-成骨级联反应启动所必需的因素，是协调成血管-成骨耦联基因程序的主要调节物。当局部缺血、缺氧时，HIF-1α、VEGF、PDGF-BB等促血管生成因子表达以激活ECs[35]。与此同时，缺氧细胞向血管元件发出信号，以确保发育中血管系统的适当分化。成骨细胞、骨细胞和ECs含有必需的细胞元件以感知和响应组织中氧气张力的变化，并在时间和空间上协调骨生成[1]。在软骨内化骨过程中，软骨内骨生长板的间充质浓缩阶段即是缺氧状态并且表达HIF-1α[36]，而HIF-1α的缺失可导致肥大软骨细胞VEGF表达下降，这表明肥大软骨细胞产生VEGF也可能受HIF-1α机制的调控。此外，HIF-1α刺激微环境中产生VEGF，先是VEGF在软骨膜中表达，刺激软骨膜血管发生，随后在增生性软骨中VEGF表达升高从而引发血管侵入软骨，继而为软骨内化骨后续过程奠定血运基础。除此之外，成骨细胞也表达HIF途径的组分，并在长骨形成过程中促进骨骼血管生成。这些研究表明缺氧是骨生成过程中诱导血管生成的主要驱动力，而HIF-1α转录因子和其靶基因VEGF是成血管-成骨耦联的关键调节因子。研究证实HIF-1α对H型ECs诱导起着关键作用，通过维持HIF-1α活性可促进H型ECs的生成，并可提高成骨细胞分泌成血管因子的能力从而促进H型血管生成[37]。

2 成血管-成骨耦联调节细胞

2.1 内皮细胞

血管与骨在物理和生物化学上存在密切联系，遗传学、生物化学和药理学研究已经证实在骨生成和修复期间ECs和成骨细胞存在相互作用。血管生成与骨生成相互耦联，也表明ECs和成骨细胞之间存在信号调控间的分子串话[38]。而ECs是血管最重要的组成部分之一，在成熟的血管系统中ECs在维持周围组织的稳态起关键作用，既为邻近组织提供交流网络，又能在需要时作为屏障来限制分子和细胞的运动[15]。此外，ECs在维持骨稳态方面同样扮演重要角色，不仅可作为高通透性屏障起作用，还可分泌活性因子促使包括造血细胞在内的循环细胞被募集到骨内。更为重要的是，Maes等[11]发现的高度特异性的H 型ECs在骨局部微环境中可以生成特异性H型血管介导循环细胞，同时促进氧气、营养物和废物的传输，还能介导成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和血管ECs之间的相互作用，释放血管分泌信号调控成骨作用和骨平衡[39-40]。在成骨过程中，ECs侵入生长板区域的软骨形成一个用于营养供应的血管通道，并作为新骨形成的支架[41]。新生成血管可确保成骨细胞前体和破骨细胞稳定转运至重塑部位，有助于进一步促进骨吸收和骨生成。除此之外，ECs易受到低氧、机械或VEGF的影响，在骨修复过程中，由于骨折后血液供应遭到破坏，氧气供应中断和周围组织的急性坏死在受伤的缝隙周围形成低氧环境，这种缺氧环境诱导成骨细胞产生HIF-1α等调节因子，继而影响ECs增殖、分化，并诱导ECs分泌成骨生长因子反作用于成骨细胞。血管和骨骼内的ECs还可以调节骨祖细胞转移到骨折部位促进骨修复，并可促进循环细胞特别是造血细胞对骨髓的调节，将它们定向转移到骨骼区域。而当ECs功能异常引起骨组织血管供应发生改变时，则会出现骨质疏松症、骨折延迟愈合甚至骨不连等骨骼病变。

2.2 内皮祖细胞

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是在骨髓和外周血中循环的另一类细胞群体，具有比成熟的ECs更强的增殖能力。研究发现EPCs能够在体外培养出EC并促进血管网络的形成，而EPCs介导的血管形成是骨生成或修复不可或缺的关键因素[42]。骨生长发育过程中新血管形成主要通过血管生成和血管发生两种方式，EPCs对以上两种方式都有积极作用。其中血管发生是指在没有预先存在的血管成分情况下，通过局部或循环EPCs的分化发生[43]，这表明EPCs在血管形成中扮演着重要角色。此外，EPCs可通过旁分泌机制诱导骨祖细胞的募集、增殖和分化，并在适当的微环境中转化为成骨细胞促进成骨作用[44]。Lee等[45]发现在大鼠牵张成骨模型中EPCs移动到缺损愈合部位的现象明显增加。Atesok等[46]证实EPCs在骨折愈合过程中引发新血管生成和新骨生成，自体EPCs移植可以促进临界尺寸缺损的血管生成和骨生成。

2.3 壁细胞

壁细胞，即骨内包含的血管周围间充质细胞群，主要分布在血管周围，其在调节造血、骨生成和血管稳态中发挥重要的功能作用。在H与L型血管周围存在着大量的多种类型的壁细胞。其中在干骺端的柱状H型毛细血管被血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)阳性细胞和神经/胶质抗原-2(neurogia -2，NG-2)细胞包围，这些壁细胞被H型ECs分泌的PDGF-B所调控[47]，在血细胞生成、骨生成和血管稳态调节中起重要功能作用。而L型窦状血管则被另外两种壁细胞包围，一种是对瘦素受体(leptin receptor，LEPR)表达阳性的LEPR+细胞，另一种是富含CXCL-12的网状细胞(CXCL-12-abundant reticular，CAR)，但对PDGFR-β和NG2表达呈阴性[48]。研究表明[49]这些壁细胞聚集在H与L型血管周围，通过分泌CXCL-12、干细胞因子和血管生成素等分子信号增强了成血管与成骨之间的密切联系和相互作用。

3 成血管-成骨耦联相互作用

ECs和成骨细胞以及成骨细胞前体空间结构上的紧密联系，既保证了二者之间进行物质交换，同时也为二者之间进行信号交流、发挥协同作用奠定了基础。Maes等[38]在由他莫昔芬诱导的转基因Rosa26R-LacZ受体小鼠实验中发现成骨细胞前体利用血管作为支持它们迁移的通道并沿着内皮的近腔表面进入骨骼，在迁移过程中血管转输而来的营养物质以及活性因子不断作用成骨细胞前体促进其逐渐向成骨细胞转化，而成骨细胞以周细胞样的方式侵入膜内血管并和ECs被吸引到同一个由肥大细胞产生并表达特殊化学引诱物的软骨，继而将ECs生成的血管“拉入”到无血管的软骨中促进软骨内成骨。最新的两篇文献[50-51]也证实了H型血管可增强成血管-成骨耦联作用，对促进新骨生成以及防治骨质疏松症具有重要意义。一方面H型血管能够产生独特的代谢和分子微环境，既能运送成骨前体细胞至特定位置，又可以释放血管分泌信号和骨生成分子进行连接，介导成骨细胞系细胞与血管ECs之间的相互作用[14，52]。此外，H型ECs可与骨祖细胞相接触，富集与骨祖细胞存活和增殖相关的生长因子，维持骨组细胞的数量和活性促进成骨细胞增殖、分化。而另一方面，成骨细胞又是骨中造血微环境中的重要组成部分，Rankin等[53]发现成骨细胞中HIF的失活导致促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)在骨骼中表达降低，而增强HIF活性可上调骨髓中造血干细胞和骨祖细胞的功能活性，通过调节成骨细胞中PHD/VHL/HIF通路可促进EPO分泌和调节红细胞生成。同时，成骨细胞中过表达HIF可使VEGF含量水平升高并形成血管化极其致密丰富的骨骼，而VEGF等生长因子信号又可以通过PI3K/AKT途径激活成骨细胞中的HIF活性，继而促进血管生成和骨生成[54]。除此之外，骨细胞也能产生吸引血管朝向代谢活跃区域发展的局域性生长因子。骨发育过程中肥大软骨细胞可释放信号刺激软骨痂的新血管生成，然后肥大软骨细胞凋亡，破骨细胞募集引发骨痂重塑及其编织骨被取代，最终被矿化以充分支持骨骼的机械需求。而如果抑制血管生成则会阻碍成骨细胞替代软骨细胞，在骨折愈合过程中则会出现组织中大量软骨细胞而非成骨细胞聚积。同理，H型ECs如果生成减少或PDGF-BB分泌下降则会导致骨生成减少而骨吸收增加，骨生成和吸收之间出现紊乱的现象，继而导致骨量流失、骨矿密度下降、骨质疏松症等问题[14，29,37]。

4 结语及展望

综上所述，在骨生长发育及维持骨量平衡过程中，血管与骨之间密切相关，成血管-成骨耦联涉及诸多生长因子、细胞和调控作用。血管对于骨骼的意义不仅体现在为骨生长和修复发挥氧气、营养物质、生长因子、代谢废物的转输作用，更为重要的是分泌因子、信号传递、功能调控等方面，而成骨细胞、骨细胞等对血管生成具有调节作用。与以往成骨细胞与破骨细胞功能耦联的二元调控机制相比，血管ECs在其中的协调作用也同样重要。然而，当前有关成血管-成骨耦联机制的研究尚不够深入，尤其是H型ECs在各种生理和病理环境中的具体作用尚未被完全阐明，而了解血管生成和骨生成之间的耦联关系将为探究骨疾病机理以及指导治疗提供新的思路和策略。