异丙酚通过miR-218抑制人食管鳞癌细胞系KYSE150的侵袭和迁移

高 虹，金 慧，刘春芝，杨静远

(吉林省肿瘤医院 1.甲状腺头颈外科；2.麻醉科, 吉林 长春 130012)

异丙酚(propofol)又名丙泊酚，是一种静脉麻醉药，具有起效快、作用时间短、苏醒快和不良反应小等特点，被广泛应用于临床诱导和维持麻醉。随着研究的深入，越来越多的证据[1-3]显示，除麻醉作用外，异丙酚在抑制肿瘤如乳腺癌、肺癌和结直肠癌等细胞增殖和转移方面发挥着重要作用。尽管异丙酚抑制食管鳞癌细胞转移的作用已被证实[4]，但是，其发挥抗肿瘤效应的分子机制并不完全明确。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类与食肿瘤发生发展关系密切的非编码RNA，可通过与靶mRNA的3′UTR结合在转录后水平负调控靶基因的表达，影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等。miR-218表达升高是异丙酚抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭的重要机制，并且miR-218可通过靶向调控高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)表达抑制胶质瘤的恶性进展[5-6]；而在食管鳞癌细胞的增殖和转移过程中，miR-218是一种重要抑癌基因[7]，HMGB1是一种重要的促癌基因[8]。然而，miR-218是否通过靶向调控HMGB1表达而参与异丙酚抑制食管鳞癌细胞侵袭和迁移的分子机制尚不清楚。因此，本研究以食管鳞癌细胞系KYSE150(esophageal squamous cancer cell line)为研究对象，探讨miR-218/HMGB1在异丙酚抑制KYSE150细胞侵袭和迁移中的作用，旨在阐明异丙酚抑制食管鳞癌细胞转移的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人食管鳞癌细胞系KYSE150(ATCC)；0.25%胰蛋白酶和RPMI1640细胞培养基(Gibco公司)；miR-218模拟物、miR-218抑制剂及其相应对照(上海吉玛制药技术有限公司)；Matrigel胶、异丙酚(Sigma-Aldrich公司)；ECL显色试剂(Bioword公司)；硝酸纤维素膜(Sartorius公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素、链霉素、RNA提取试剂Trizol和转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术研究所)，羊抗HMGB1多克隆抗体和兔抗GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz公司)，辣根过氧化酶标记的二抗(北京中杉生物公司)；pcDNA3.1-HMGB1-GFP过表达质粒和空载体pcDNA3.1质粒(BioVector质粒载体基因保藏中心)。反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher公司)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Bio-Rad公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：用含100 U/mL青链霉双抗和10%胎牛血清的RPMI1640培养基在条件为37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中常规培养KYSE150细胞。待细胞达80%汇合时，以0.25%胰蛋白酶消化，并按照1∶3比例传代。取长势良好的第4代对数增殖期细胞进行实验。

1.2.2 Transwell小室法检测细胞侵袭：将对数增殖期的KYSE150细胞以每孔200 μL(106个/mL)接种至24孔板上，于恒温培养箱内常规培养过夜。分别加入终浓度为2.5、5和10 μg/L的异丙酚，并以0 μg/L异丙酚作为对照，其中每个浓度设置3个平行孔。常规培养过夜后，次日收集各处理组细胞，并以无血清培养基制备105个/mL的细胞悬液。取细胞悬液100 μL加入到Matrigel基质胶包被的Transwell小室上室中，同时在下室中加入500 μL有血清的培养基。培养过夜后，取出小室，以磷酸缓冲液洗涤细胞，再分别以50 g/L的戊二醛、0.1%结晶紫固定和染色15 min。洗去染色液后，在倒置显微镜下随机取5个视野，观察统计穿膜细胞数，结果以3次实验的穿膜细胞数均值表示侵袭细胞数。

1.2.3 划痕实验检测细胞迁移：先用记号笔在6孔细胞板的背面以0.5 cm的间隔穿孔划痕，每孔需要5条线穿过。将对数增殖期的KYSE150细胞以105个/孔种植于6孔细胞板上，常规培养过夜，次日分别加入终浓度为0、2.5、5和10 μg/L的异丙酚处理过夜，每组设置3个平行孔。待细胞汇合达80%时，使用10 μL移液枪枪头垂直于背后的横线划痕。以磷酸缓冲液洗去脱落的细胞后，加入无血清培养基继续培养，按照0、24 h取样，在倒置显微镜下随机选取5个视野，测量细胞的迁移距离，以公式：细胞迁移率(%)=(0 h划痕距离-24 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%计算出各组细胞的迁移率。

1.2.4 RT-qPCR检测细胞中miR-218的表达：收集0、2.5、5和10 μg/L异丙酚处理24 h的KYSE150细胞，采用Trizol法提取各处理细胞的总RNA，用反转录试剂盒进行反转录。再以转录产物cDNA为模板，以上海生工生物合成的引物，按照扩增程序(94 ℃ 300 s；94 ℃ 15 s、6 0℃ 15 s、72 ℃ 30 s，循环35次)进行PCR扩增。采用2-△△Ct法分析各处理组细胞中miR-218表达。

1.2.5 Western blot检测细胞中HMGB1蛋白的表达：收集0、2.5、5和10 μg/L异丙酚处理24 h的KYSE150细胞，加入蛋白裂解液RIPA提取各组细胞总蛋白，并参照BCA蛋白检测试剂盒说明书对总蛋白进行定量。将蛋白样品与上样缓冲液按照1∶1比例混合均匀，置于95 ℃中煮沸5 min。将变性后的蛋白样品按照60 μg/孔上样，行SDS-PAGE电泳分离。待电泳结束后，转NC膜。将膜浸泡于5%脱脂奶粉中封闭1 h后，1∶800 HMGB1抗体和1∶1 000 GAPDH 抗体，在4 ℃下孵育过夜，再加入1∶2 000辣根过氧化酶标记的二抗，在室温下孵育1h。滴加ECL显色试剂，并在暗室内显影曝光后，以GAPDH为内参，使用凝胶成像系统分析HMGB1蛋白的表达水平。

1.2.6 细胞的转染：将对数增殖期的KYSE150细胞以105个/孔种植于6孔板上，常规培养过夜。miR-218对HMGB1蛋白的调控实验分为4组，分别为1)miR-218组：转染miR-218模拟物；2)anti-miR-218组：转染miR-218抑制剂；3)miR-NC组：转染miR-218模拟物阴性对照；4)anti-miR-NC组：转染miR-218抑制剂阴性对照。另接种两板细胞，一板用以miR-218恢复实验，实验分为4组，分别为1)对照组：未经任何处理；2)异丙酚组：只给予10 μg/L异丙酚处理而未转染；3)异丙酚+anti-miR-218组：转染miR-218抑制剂24 h后给予等浓度异丙酚处理；4)异丙酚+anti-miR-NC组：转染miR-218抑制剂阴性对照24 h后给予等浓度异丙酚处理。一板用以HMGB1恢复实验，实验分为4组，分别为1)对照组：同上；2)异丙酚组：同上；4)异丙酚+HMGB1组：转染pcDNA3.1-HMGB1-GFP质粒24 h后给予等浓度异丙酚处理；4)异丙酚+pcDNA3.1组：转染pcDNA3.1质粒后给予等浓度异丙酚处理。待细胞汇合度达70%时，参照转染试剂Lipofectamine 2000说明书根据实验分组进行瞬时转染。转染后根据实验给予相应处理后，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.7 双荧光素酶活性检测miR-218和HMGB1的靶向关系：应用生物信息学软件TargetScan、miRanda及miRBase预测到HMGB1 3′UTR区域和miR-218存在互补的核苷酸序列。将HMGB1 3′UTR片段克隆至psiCHECK-2荧光素酶载体上，构建野生型psiCHECK-2-HMGB1(HMGB1-WT)报告基因质粒。另外将HMGB1 3′UTR中与miR-218结合的位点进行定点突变，构建突变型psiCHECK-2-HMGB1(HMGB1-MUT)报告基因质粒。参照lipofectamine 2000说明书将HMGB1-WT和HMGB1-MUT载体分别与miR-218模拟物、miR-218抑制剂及其阴性对照共转染至KYSE150细胞中，转染48 h后，应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 异丙酚抑制食管鳞癌细胞KYSE150侵袭与迁移

与对照组(0 μg/L)相比，异丙酚处理组中侵袭细胞数和迁移率均呈浓度依赖性降低(P<0.05)(图1,表1)。

A.transwell test;B .scratch test

表1 不同浓度异丙酚对KYSE150细胞侵袭和迁移的影响

*P<0.05 compared with 0 μg/L;#P<0.05 compared with 1 μg/L;△P<0.05 compared with 5 μg/L.

2.2 异丙酚上调食管鳞癌细胞KYSE150中miR-218表达并下调HMGB1蛋白的表达

异丙酚处理组细胞中miR-218表达呈浓度依赖性升高(P<0.05),而HMGB1蛋白的表达水平均呈浓度依赖性降低(P<0.05)(图2，表2)。

图2 不同浓度异丙酚对miR-218和HMGB1蛋白的表达的影响

表2 不同浓度的异丙酚对KYSE150细胞中miR-218和HMGB1蛋白表达的影响

*P<0.05 compared with 0 μg/L;#P<0.05 compared with 1 μg/L;△P<0.05 compared with 5 μg/L.

2.3 HMGB1是miR-218的靶基因

应用生物信息学软件预测发现，miR-218与HMGB1 3′UTR区域存在互补的核苷酸序列(表3)。双荧光素报告基因实验显示，与miR-NC组相比，与HMGB1-WT共转染的miR-218组细胞荧光素酶活性明显降低(P<0.05)；而与HMGB1-WT共转染的anti-miR-218组细胞的荧光素酶活性较anti-miR-NC组明显升高(P<0.05)(表4)。

表3 HMGB1 3′UTR与miR-218的结合位点

表4 各组细胞的荧光素酶活性

*P<0.05 compared with the miR-NC group;#P<0.05 compared with anti-miR-NC group.

2.4 miR-218可负向调控食管鳞癌细胞KYSE150中HMGB1蛋白表达

与miR-NC组相比，miR-218组细胞中miR-218的表达水平明显升高，而HMGB1蛋白的表达明显降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-218组细胞中miR-218的表达水平明显降低，而HMGB1蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)(图3,表5)。

2.5 下调miR-218减轻异丙酚对食管鳞癌细胞KYSE150侵袭、迁移的抑制作用

与对照组相比，以10 μg/L异丙酚处理后的异丙酚组中miR-218的表达水平明显升高，而侵袭细胞数和迁移率均明显降低(P<0.05)；与异丙酚组相比，异丙酚+anti-miR-218组中miR-218表达水平明显降低，而侵袭细胞数和迁移率均明显升高(P<0.05)(图4，表6)。

图3 miR-218对KYSE150细胞中HMGB1蛋白表达的影响

表5 miR-218对KYSE150细胞中HMGB1蛋白表达的影响

*P<0.05 compared with the miR-NC group;#P<0.05 compared with anti-miR-NC group.

表6 下调miR-218对KYSE150细胞侵袭和迁移能力的影响

Compared with the control group,*P<0.05;#P<0.05 compared with propofol group.

图4 下调miR-218对KYSE150细胞侵袭(A)和迁移(B)能力的影响

2.6 上调HMGB1表达可逆转异丙酚对食管鳞癌细胞KYSE150侵袭、迁移的抑制作用

与对照组相比，异丙酚组中HMGB1蛋白的表达水平以及侵袭细胞数、迁移率均明显降低(P<0.05)；与异丙酚组相比，异丙酚+HMGB1组HMGB1蛋白的表达水平、侵袭细胞数和迁移率均明显升高(P<0.05)(图5,6，表7)。

图5 Western blot检测各组细胞中HMGB1蛋白的表达

图6 上调HMGB1表达对KYSE150细胞侵袭(A)和迁移(B)能力的影响

表7 上调HMGB1表达对KYSE150细胞侵袭和迁移能力的影响

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with propofol group.

3 讨论

食管癌是一种侵袭性很强的消化系统恶性肿瘤，在中国具有较高的发病率和病死率，其中鳞癌是其主要的病理类型；目前，以手术切除为主的综合治疗模式仍是食管癌的主要治疗手段，而手术过程中麻醉药是否具有抑癌作用以及如何发挥的作用逐渐引起人们的关注。

异丙酚是一种临床常用的静脉注射麻醉剂，除了镇静和麻醉作用外，还证实具有抑制肿瘤生长和转移的作用[9]。随着异丙酚在肿瘤中的深入研究，越来越多的证据显示，miRNAs在异丙酚调控肿瘤细胞转移等过程中发挥着重要作用。例如：miR-374a可通过靶向调控TP53影响着异丙酚抑制肝癌细胞侵袭和迁移等作用[9]。miR-21低表达调控PI3K/KT和Wnt/β-catenin信号通路是异丙酚抑制乳腺癌细胞增殖和上皮间质转化的重要机制[10]。下调的miR-372导致Wnt/β-catenin和mTOR信号通路失活是异丙酚抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的重要机制[11]。

尽管异丙酚对食管癌细胞转移的作用已有报道[4]，但异丙酚是否通过调控某些miRNAs的表达发挥作用并不清楚。miR-218是一种与肿瘤细胞恶性进展密切相关的miRNA，被证实肿瘤组织和细胞中异常低表达，可通过影响细胞侵袭和迁移等行为发挥着重要的抑癌作用[12]。miR-218在食管癌中低表达，可通过调控细胞侵袭和迁移在食管癌发生发展过程中发挥着抑癌基因的作用[7]。本研究以食管癌细胞系KYSE150为研究对象，以0、2.5、5和10 μg/L的异丙酚处理后发现，异丙酚可呈浓度依赖性抑制KYSE150细胞的侵袭和迁移。该结果与报道的异丙酚抑制食管鳞癌EC9706细胞侵袭和迁移的结果相一致[4]。此外，本研究还发现，异丙酚可呈浓度依赖性上调miR-218表达；进一步转染miR-218抑制剂成功下调miR-218表达后发现，异丙酚对KYSE150细胞的侵袭和迁移的抑制作用明显减弱。异丙酚可通过上调miR-218抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭[6]。结果提示，miR-218可能在异丙酚抑制食管鳞癌KYSE150细胞侵袭和迁移过程中发挥着积极作用。

此外，本研究还发现异丙酚可呈浓度依赖性下调HMGB1的表达；生物信息学软件预测HMGB1 3′UTR存在能够与miR-218互补的核苷酸序列；双荧光素酶报告基因实验证实miR-218可与HMGB1 3′UTR靶向结合，同时Western blot实验证实miR-218可负向调控HMGB1蛋白的表达。这一系列结果证实HMGB1是miR-218的靶基因。这一结果与在胰腺癌研究中得到HMGB1是miR-218靶基因的结论相一致[13]。另外，同时上调HMGB1表达可逆转异丙酚对KYSE150细胞侵袭和迁移的抑制作用。HMGB1是一种由215个氨基酸组成的非组蛋白染色质结合蛋白，在肿瘤组织或细胞中异常高表达，并在肿瘤细胞转移过程中发挥着重要的促进作用[14]。HMGB1在食管癌侵袭和迁移过程中发挥着重要的促进作用[8]，异丙酚可下调小胶质细胞中HMGB1的表达[15]。结果提示，miR-218可能通过靶向调控HMGB1在异丙酚抑制食管癌细胞KYSE150侵袭和迁移过程中发挥着重要作用。

综上所述，miR-218在异丙酚抑制食管鳞癌细胞KYSE150侵袭和迁移过程中发挥着积极作用，其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。该结果为异丙酚有望成为食管癌手术过程中理想的麻醉剂提供了新的参考依据。