硫氧还蛋白-1通过调控IRE1-JNK信号通路改善血管性痴呆大鼠认知功能和神经损伤

余秀 易琳琳 王悦

(内江市第一人民医院神经内科，四川 内江 641000)

血管性痴呆(VD)被认为是继阿尔茨海默病之后最常见的痴呆类型〔1，2〕。据预测，到2040年全球痴呆病人将达到8 110万例，其中中国痴呆病人将是所有发达国家痴呆病人的总和〔3〕。包括肌醇酶(IRE)1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路介导的内质网应激在内的氧化应激被认为在VD发病机制中起重要作用〔4〕。硫氧还蛋白(Trx)-1是一种重要的二硫化还原酶，在控制细胞氧化还原状态中起重要作用〔5〕。本实验研究Trx-1过表达对VD模型大鼠海马组织神经损伤的保护及认知能力的改善作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 50只6～7周龄SPF级健康雄性SD大鼠，体重(260±20)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(湘)2014-0010。HEK293T人胚肾上皮细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。Trx-1重组慢病毒质粒pLV-EF1a-EGFP(2A)-Puro-Trx-1及包装质粒PH1、PH2由北京英茂盛业生物科技有限公司设计并构建；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；青霉素、链霉素购自上海拜力生物科技有限公司；IRE1靶向抑制剂KIRA6购自美国MedChemExpress公司；全蛋白提取、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量测定试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；超敏电化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；兔抗人Trx-1多克隆抗体、兔抗人磷酸化IRE1〔p-IRE1(S724)〕多克隆抗体购自英国Abcam公司；小鼠抗人磷酸化JNK〔p-JNK(Thr183/Tyr185)〕单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G和HRP标记的山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。Morris水迷宫购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司产品；光学显微镜购自日本Olympus公司产品；HHQ-2158轮转式切片机购自杭州艾普仪器设备有限公司产品；Tanon-4100全自动数码凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司产品。

1.2HEK293T细胞的培养及Trx-1重组慢病毒的制备 将HEK293T细胞置于含有100 ml/l FBS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM中，37℃、5%CO2的培养箱中培养。转染前，取生长状态良好的处于对数生长期的HEK293T细胞，提前2 d接种于培养皿中。更换新鲜培养基，取5 μg Trx-1重组慢病毒质粒pLV-EF1a-EGFP(2A)-Puro-Trx-1、3.75 μg辅助质粒PH1和1.25 μg PH2质粒与相应体积的Opti-MEM混合均匀，总体积为2.5 ml，于室温下孵育5 min，以空载重组质粒作阴性对照。取100 μl LipofectamineTM2000与2.4 ml Opti-MEM混合，室温孵育5 min。再将两种Opti-MEM混合液混合形成转染复合物，共转染HEK293T细胞。转染72 h后，收集细胞上清液，离心、过滤。上清液于4℃、25 000 r/min离心2 h，所获病毒分别命名为Lv-Trx-1〔病毒滴度：1.1×108转导单位(TU)/ml〕和Lv-NC(病毒滴度：0.9×108TU/ml)，-80℃保存备用。

1.3双侧颈总动脉夹闭再通法构建VD大鼠模型 参照王蕊等〔6,7〕推荐的方法进行造模。大鼠适应性喂养1 w后，采用2%的戊巴比妥钠(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，后仰卧位将大鼠固定于手术台上，颈部皮肤剪毛暴皮，常规消毒处理；采用手术刀于颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，随机用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭10 min再通10 min，重复一次；后在手术切口处施以适量青霉素消毒并缝合伤口，放回笼中日常饲养。

1.4动物分组及干预 按体重将SD大鼠随机分成假手术组(Sham组)、模型组(VD组)、Trx-1过表达空载慢病毒干预组(VD/Lv-NC组)、Trx-1过表达慢病毒干预(VD/Lv-Trx-1组)及肌醇酶(IRE)1抑制剂KIRA6干预组(VD/KIRA6组)各10只。各干预组及模型组建立VD模型。VD/Lv-NC及VD/Lv-Trx-1组在造模前24 h侧脑注射对应慢病毒溶液0.2 ml；VD/KIRA6组在造模前2 h侧脑注射KIRA6溶液(剂量10 mg/kg)；Sham及VD组则注射等量生理盐水。

1.5Morris水迷宫实验检测认知能力〔8〕造模24 h 后，参照参考文献对各组进行Morris水迷宫实验检测认知能力。其中定位航行实验主要记录实际逃避潜伏期；而后续的空间探索实验则记录120 s内跨越原平台的次数。

1.6苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织海马区病理变化〔9〕水迷宫实验结束后，断头处死各组并取脑组织，区视交叉后至小脑前部分，作两道垂直切口，剥离海马区，并分成两等份。一部分保存于4%多聚甲醛固定48 h，另一部分-80℃冻存备用。取固定48 h的海马区标本，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作病理切片(厚度3～5 μmol/L)。将石蜡切片依次再经脱蜡、HE染色、分化及蓝化后HE染色、洗涤脱水及透明后封片。光镜下观察染色并采集图片。

1.7TUNEL染色检测海马区细胞凋亡〔10〕将海马区石蜡切片依次进行TUNEL染色处理：烤片和脱蜡；水化；蛋白酶K工作液常温孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反应混合液于样品上，在湿盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次；加入50 μl转化剂POD于样品上，在湿盒中37℃避光孵育30 min；用PBS冲洗3次；加入100 μl DAB底物，于15～25℃孵育10 min；用PBS冲洗3次；HE复染、脱水、透明；封片，光镜下随机选择5个视野，阳性染色的细胞核成棕褐色，即凋亡细胞，凋亡率以高倍镜下计数1 000个细胞中阳性细胞百分比表示。

1.8Western印迹检测蛋白表达〔11〕取-80℃冻存的海马组织，分别进行蛋白提取后进行浓度检测；取20 μg蛋白和4 μl 2×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液混合均匀，100℃变性10 min；上样，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用5%脱脂牛奶封闭1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分别加入一抗在4℃下，孵育过夜；PBS洗膜；加入HRP标记的二抗IgG室温孵育0.5 h；PBS洗膜；用电化学发光进行显色。以GAPDH为内参蛋白，后采用Quantity One图像处理软件对各指标灰度值进行半定量分析。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、Tukey检验。

2 结 果

2.1各组认知能力比较 与Sham组比较，VD组逃避潜伏期显著延长、跨越原平台次数显著减少(P<0.01)；与VD组比较，VD/Lv-Trx-1组及VD/KIRA6组逃避潜伏期显著缩短、跨越原平台次数显著增多(P<0.01)，见表1。

表1 各组Morris水迷宫实验结果

与Sham组比较:1)P<0.01;与VD组比较:2)P<0.01；下表同

2.2各组海马区病理改变比较 Sham组脑组织海马区锥体细胞形态结构完整，轮廓清晰可见，排列整齐，细胞数目多，核仁明显，胞质丰富；VD组与VD/Lv-NC组脑组织海马区病理改变类似，锥体细胞排列杂乱，基质疏松，细胞脱失显著，部分细胞出现核固缩、溶解等现象；而VD/Lv Trx-1组及VD/KIRA6组海马区病变稍轻微，仅少量锥体细胞变性、脱失或核固缩，锥体细胞排列较整齐，核仁较清晰，见图1。

图1 各组海马区病理学变化(HE，×200)

2.3各组海马区细胞凋亡情况比较 与Sham组〔(5.01±0.24)%〕比较，VD组〔(25.41±2.36)%〕差异显著升高(P<0.01)；与VD组比较，VD/Lv-Trx-1组〔(10.15±1.24)%〕和VD/KIRA6组〔(9.48±0.89)%〕均显著降低(P<0.01)。VD/Lv-NC组神经细胞凋亡率为〔(22.78±1.87)%〕。

2.4各组海马区Trx-1、p-IER1和p-JNK蛋白相对表达水平 与Sham组比较，VD组Trx-1蛋白表达显著降低(P<0.01)，p-IRE1和p-JNK水平显著升高(均P<0.01)。与VD组比较，VD/Lv-Trx-1组和VD/KIRA6组Trx-1蛋白表达显著升高(P<0.01)，p-IRE1和p-JNK水平显著降低(均P<0.01)，见表2。

表2 各组海马区Trx-1、p-IER1和p-JNK蛋白相对表达水平

3 讨 论

研究显示，缺血性神经元损伤发生的同时，Trx-1的表达会发生明显变化。在大脑中动脉闭塞(MCAO)模型中发现，Trx-1的表达及免疫活性降低〔12〕。而Trx-1过表达明显改善缺血再灌注所致的神经元损伤〔13〕。相反，Trx-1-siRNA对于缺血再灌注的干预则增加了模型动物神经功能缺损、脑梗死和脑积水〔14〕。因此猜测过表达Trx-1同样能改善VD模型大鼠的认知能力和神经损伤。

Morris水迷宫实验是目前世界上公认的较为客观的认知能力评价方法。本研究提示Trx-1过表达与IRE1抑制剂KIRA6均能改善VD大鼠的认知能力，对VD起一定的治疗作用。HE染色结果同样也说明了这一点。

细胞凋亡是一种重要的生命现象，不仅出现在生理状态下，更与包括VD在内的多种疾病发生密切相关〔15〕。而内质网应激可启动细胞凋亡，这是近年才发现的一条新的细胞凋亡信号传导通路〔16〕。在内质网应激反应早期，IRE1被激活并具有核酸内切酶活性，引导蛋白正确折叠，使细胞恢复正常状态；但如果应激继续加重，IRE1就会激活JNK激酶诱发细胞凋亡〔17〕。在本研究中发现，Trx-1过表达显著抑制了VD大鼠海马区神经细胞的凋亡，且IRE1抑制剂KIRA6干预同样抑制了海马区神经细胞的凋亡；此外，免疫印迹检测结果显示Trx-1过表达与IRE1抑制剂KIRA6均能显著抑制VD大鼠IRE1-JNK信号通路的激活。综上，慢病毒介导的Trx-1过表达能显著保护VD大鼠的神经损伤、改善认知功能障碍，且这一效应可能与抑制内质网应激相关信号通路IRE1-JNK的活化有关。