胶质母细胞瘤免疫治疗研究现状与展望

郑兰 林贞花 杨洋

(延边大学医学院病理学教研室 吉林省科技厅重点实验室，吉林 延吉 133002)

神经胶质瘤在成人中是一种最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤(GBM)发病率占50%以上〔1〕，是最具侵袭性的亚型，患者中位生存期约18个月〔2〕。目前GBM的标准治疗方案包括手术治疗、结合放疗和化疗〔3〕。然而，由于GBM肿瘤细胞的浸润性生长及受肿瘤部位制约，手术难以完整切除肿瘤。此外放化疗无法特异性识别肿瘤细胞，且易耐药，患者临床获益甚微。近来有研究发现大脑通过脑膜淋巴管与外周免疫系统相连〔4〕，这一重要发现使得肿瘤免疫治疗有望成为GBM最具前景的治疗策略，为其治疗提供了新的方向。本文就目前GBM 免疫治疗的策略及与临床试验结果相关的生物学标记物的研究进展做一综述。

1 免疫检查点抑制剂

T细胞表面的抑制性受体，即免疫检查点，可降低T细胞对肿瘤细胞的免疫应答。免疫检查点抑制剂可通过提高免疫检查点调解T细胞活性，从而诱导持续的抗肿瘤免疫应答。免疫检查点抑制剂的应用为晚期癌症的治疗带来了近乎革命性的改变。免疫检查点抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白(PD)-1，其配体PD-L1和4型细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)抑制剂，能够改变人体免疫系统，从正常的适应性免疫系统转变为增强的免疫活化系统。在临床前研究中检查点抑制剂显示出治疗GBM的前景。目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准的免疫检查点抑制剂包括ipilimumab(CTLA-4 抑制剂)，pembrolizumab和nivolumab(PD-1抑制剂)及durvalumab，atezolizumab和avelumab(PD-L1抑制剂)。PD-1抑制剂联合CTLA-4抑制剂〔5〕和放射治疗〔6〕能显著延长GBM模型小鼠生存期。Checkmate143观察nivolumab对复发性GBM患者中位总生存时间(OS)无改善作用。Filley等〔7〕分析该结果可能与GBM肿瘤微环境的免疫抑制，系统免疫抑制及抗体无法通过血脑屏障有关；在复发性GBM中免疫检查点抑制剂在重新激活免疫细胞方面效果较差；此外该研究在终止免疫治疗前没有通过病理检查证实肿瘤复发，因很难区分炎症治疗反应和肿瘤进展，可能导致过早终止试验。目前关于抗LAG3检查点抑制剂联合PD-1和CD137抑制剂治疗复发性GBM的临床试验正在进行，结果尚未公布(NCT02658981)。

2 肿瘤疫苗

一般来说，疫苗将免疫系统暴露在一个被削弱或被杀死的抗原下，以建立免疫记忆，以抵御未来任何对该抗原的暴露。肿瘤疫苗作用机制与此类似，可利用肿瘤相关抗原激活特异性T细胞并诱导炎症反应，增强机体抗肿瘤能力，达到抑制肿瘤目的。

2.1树突细胞(DCs)疫苗 DCs是骨髓来源淋巴细胞CD4+和CD8+T细胞的抗原提呈细胞(APC)，在主要组织相容性复合体(MHC)环境下也是自然杀伤(NK)细胞和NK-T细胞的激动剂。在GBM微环境中MHC表达下调，抗原提呈效率下降〔8〕，使得有效的抗原提呈对大脑成功的免疫治疗至关重要。在小鼠中研究发现外周注射DC疫苗能诱导细胞毒性T淋巴细胞在中枢神经系统(CNS)的应答而不产生自身免疫应答；DC疫苗有靶向抑瘤作用，对正常脑组织无损伤〔9〕。CD133+细胞是潜在的脑肿瘤启动细胞，也是GBM肿瘤干细胞常用标记物〔10〕，与GBM对放、化疗抵抗及放疗后肿瘤复发密切相关。Ⅰ期临床试验结果发现载有ICT-121的DCs(CD133致敏)能显著延长表达人类白细胞抗原(HLA)-A2的复发性GBM患者的生存期(NCT02049489)。在Ⅲ期临床试验中Liau等〔11〕采用自体肿瘤裂解液构建的DCVax-L疫苗治疗已接受标准放疗联合莫替唑胺(TMZ)化疗的GBM患者，其OS达到了23.1个月。大量的临床试验(NCT01808820、NCT02649582、NCT02529072、NCT01567202、NCT0-1567202、NCT01204684、NCT00639639、NCT02465268)仍在进行中。

2.2多肽疫苗 多肽疫苗中被广泛研究的靶点是表皮生长因子受体(EGFR)。在GBM中EGFR高表达，常发生突变，其中EGFRRvⅢ截短突变体最为常见。与野生型EGFR比较，EGFRRvⅢ没有配体结合域，因此呈持续激活状态，促进GBM发生，因此EGFRRvⅢ可作为免疫治疗的肿瘤特异性靶点。Ⅱ期临床试验发现接受EGFRvⅢ靶向肽类疫苗-Rindopepimut(CDX-110)治疗GBM初诊患者无进展生存期(PFS)和OS分别延长至14.2个月和26个月，无明显不良反应〔12〕。细胞替代疗法(ACT)-Ⅱ试验发现GBM初诊患者接受Rindopepimut与TMZ联合治疗后生存获益，但TMZ高剂量治疗患者表现为更重的毒性作用，如骨髓移植和淋巴细胞减少症。ACT-Ⅲ试验中纳入65例GBM初诊患者接受Rindopepimut与TMZ联合治疗，患者PFS和中位OS均延长，而且85%患者抗EGFRvⅢ抗体滴度升高〔13〕。ACT-Ⅳ试验〔14〕在期中分析后终止，结果发现Rindopepimut不能延长新诊断胶质瘤患者OS。ReACTⅡ期临床试验结果表明Rindopepimut+血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体——bevacizumab能有效延长GBM复发患者PFS〔15〕。除了靶向EGFRvⅢ外，正在进行的临床试验使用针对多种抗原的疫苗，例如IMA950试验〔16〕靶向11种肿瘤相关肽，这种多肽方法可以克服针对单一肿瘤相关抗原时常见的抗原丢失。进一步的临床试验(NCT03223103、NCT02864368、NCT02754362、NCT-02722512、NCT02455557、NCT02287428)仍在进行中。

2.3热休克蛋白(HSPs)疫苗 HSPs能够广泛激活先天性和获得性免疫系统，同时能够上调MHCⅠ和MHCⅡ抗原表达，诱导抗肿瘤免疫反应。在HSP家族中，HSP70和HSP96具有护送抗原转交给APC并结合至MHC-Ⅰ类分子上的功能。所以当HSP96结合具有肿瘤特异性的抗原多肽，就能够诱导特异性肿瘤免疫反应。Ⅰ期临床试验发现接受HSP96肽复合物疫苗治疗的12例复发GBM中有11例肿瘤部位出现免疫应答，无显著不良反应；11例免疫应答患者中位OS为47 w，1例无免疫应答患者生存期为16 w〔17〕。Ⅱ期临床试验结果发现疫苗与TMZ联合应用安全有效〔18〕。此外，PD-L1在迁移的骨髓细胞中表达诱导系统免疫抑制，能够削弱疫苗的作用。在新诊断的GBM患者中MGMT甲基化、Karnofsky表现评分(KPS)和PD-L1表达水平是疫苗有效性的预后指标〔19〕。相关临床试验(NCT01814813、NCT02722512、NCT03650257)仍在开展中。

3 ACT

ACT是近年来备受瞩目的治疗多种恶性肿瘤的免疫治疗方法，发展迅速。目前已体现出广泛的治疗范围，包括多种治疗方式：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫治疗、T细胞受体(TCR)治疗，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗。

3.1TIL治疗 TIL存在于肿瘤周围，具有增强的肿瘤特异性。该治疗包括肿瘤切除后TIL收集，扩增和白细胞介素(IL)-2刺激，回输到患者体内4个步骤。TIL治疗GBM可能是一种很有前景的治疗模式，但由于其潜在的毒性作用和细胞因子释放综合征的风险，TIL治疗中枢神经系统恶性肿瘤还需要进一步研究。

3.2TCR治疗 TCR治疗是利用患者外周血中修饰后的T细胞(表达肿瘤特异性α和β链)增强对实体肿瘤的抗原识别。备受关注的临床应用包括靶向T细胞识别的黑色素瘤相关抗原(MART)-1(NCT00509288)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A3〔20〕和纽约食管鳞状细胞癌抗原(NY-ESO-1)〔21〕。以上研究发现转移性黑色素瘤和滑膜肉瘤患者接受TCR治疗后出现部分免疫应答细胞替代疗法。目前TCR靶向特异性抗原尚未在GBM中进行试验，但这些抗原也存在于GBM中，因此TCR对其他癌症的疗效值得进一步研究〔22〕。

3.3CAR-T细胞治疗 第一代CARs只简单设计了一个抗原识别域，第二代及其后CARs拥有额外的共同刺激域，如CD28和4-1BB能够降低激活屏障并优化受体功能。在GBM中，CAR-T细胞靶向3种GBM特异性抗原：人类表皮生长因子受体(HER)2、IL13Rα2或EGFRvⅢ。

HER2是络氨酸激酶受体，在80%GBM患者中过表达。在2010年一项应用CAR-T细胞靶向HER2Ⅰ期临床试验已完成。值得注意的是这些CARs是利用CD28信号域生产并依据其自然识别巨噬细胞(CMV)的能力进行预选，在GBM微环境中可能增强这些细胞的治疗效果同时能靶向CMV相关肽。该研究共纳入16例HER2阳性的GBM复发患者，二代合成的HER2-CAR CMV-T细胞治疗后1例患者表现部分应答，OS>9个月；7例病情稳定，OS达29个月；仅7例患者能够在治疗6 w后采集的血液标本中检测出HER2-CARs，而且其表达水平持续下降，说明CARs不能在体内扩增〔23〕。目前如何延长CAR-T细胞存活时间仍是一个重要挑战。

IL-13Rα2是另一个被寄予厚望的抗原，在约75%的GBM患者中表达。Brown等〔24〕进行了一项队列研究中纳入3例高级别胶质瘤(HGG)患者，利用第一代CAR-T细胞针对IL13Rα2经颅内注射至手术部位，患者没有因缺乏IL13Rα2抗原则被排除。总体上所有3例HGG患者在治疗后表现为肿瘤中IL13Rα2表达下调，复发后平均OS为11个月。随后该团队利用第二代IL-13Rα2-41BB共刺激CAR-T细胞，通过腔内注射、肿瘤内注射或心室内灌注方法治疗复发或难治性HGG患者，该研究仍在进行中，最终结果尚未公布。该研究中1例多病灶复发的GBM患者被证明完全应答，生存7.5个月。该例患者采用腔内灌注治疗，直至发现疾病进展，此时房内灌注CAR-T细胞，导致短暂的完全应答，但值得注意的是，复发最终以远端转移的形式发生，表达较低水平的IL13Rα2。尽管该研究入组患者例数较少，但为后续研究奠定了基础。

针对EGFRvⅢ的Ⅰ期临床试验，目前仍在进行(NCT01454596)。该研究发现10例患者中有7例在治疗后再次手术，3例组织中EGFRvⅢ表达下调，2例完全转阴。值得注意的是CAR-T细胞治疗后肿瘤的手术标本的肿瘤微环境中PD-L1、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、转化生长因子(TGF)-β及FoxP3+Tregs显著上调。该结果表明肿瘤细胞适应了该CAR-T细胞治疗通过激活多种免疫抑制通路发生免疫逃逸。进一步的体内动物模型研究表明，可以通过其他免疫调节疗法靶向这种相互免疫抑制从而获得CAR-T细胞治疗的持久抗肿瘤反应〔24〕。

4 病毒疗法

病毒治疗使用复制能力强的病毒，尽管是减毒或转基因的，利用溶瘤和非溶瘤机制的优势，靶向高级别GBM。这些病毒治疗剂的临床应用面临一个实际的巨大挑战：既需要能够通过血脑屏障达到充分的血药浓度，又需要最大限度地降低全身毒性的风险。对流增强交付(CED)技术已被用来克服这些方面的挑战。PRECISE治疗是截至目前唯一完成的Ⅲ期CED治疗GBM的评估。该试验使用了一种突变的铜绿假单胞菌毒素与重组IL-13结合而成的嵌合细胞毒素cintredekin besudotox，通过CED，该细胞毒素靶向表达IL-13受体的细胞。结果发现与植入Gliadel晶圆相比，复发性GBM的PFS增加，但OS没有改善〔25〕。这次试验的失败可能归因于不足70%的导管是按照规定放置的；同时，尽管CED组达到了统计所需的总体存活率的显著性，对照组OS比预期明显延长，减少了两者结果的差异。经CED在复发性恶性胶质瘤注入Delta-24-RGD溶瘤病毒的动物试验和Ⅰ期临床试验已完成。研究发现在接受病毒治疗2 w后切除的肿瘤组织中仍有活跃的病毒复制，但在治疗6 w和2.5年后切除的肿瘤组织中却没有发现这一现象。此外，接受腺病毒治疗4 w后切除组免疫细胞浸润增强，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3表达降低。因为TIM-3在T细胞中表达被认为是T细胞耗竭的标志，说明治疗后促进了肿瘤微环境中T细胞的功能。与治疗后2 w切除的肿瘤组织比较，治疗后4 w切除的组织免疫反应显著增强，研究者认为肿瘤消退是因为继发迟发性免疫反应，而不是直接的溶瘤作用〔26〕。

5 未来的研究方向和生物学标志物

即使是在最成功的癌症免疫治疗试验中，仅一小部分患者获益。临床中仍缺乏有效的生物学标志用于预测患者对免疫治疗的应答。迄今为止在GBM患者中免疫表型分析受到限制，因为分析过程通常依赖于重复的组织取样。虽然立体定向活检的并发症发生率相对较低，但重复活检在胶质瘤临床试验中并不被认为是标准做法，临床研究中大多没有通过组织检查确认肿瘤复发或进展，而免疫治疗引起的炎症反应很难与肿瘤进展相鉴别。Desjardins等〔27〕报道GBM患者在溶瘤腺病毒(Delta-24-RGD)治疗后其T细胞内TIM-3表达水平上调，说明该治疗促进了T细胞功能。Ali等〔28〕报道EGFRvⅢ CAR-T细胞治疗后切除的肿瘤组织中PD-L1，IDO和TGF-β及FoxP3+Tregs表达水平上调，可能反映了肿瘤的适应性和免疫逃逸。然而，低侵入性的血清生物标志物也得到了有效的应用。在Rindopepimut的Ⅲ期ACT-Ⅳ试验中，研究人员使用EGFRvⅢ抗体的血清滴度来监测接种后宿主对疫苗的免疫反应程度〔29〕。Guo等〔30〕自体头部HSP肽疫苗治疗在GBM的Ⅱ期试验中发现，外周血髓细胞PD-L1表达低的患者总体OS为45个月，而表达高的患者OS为18个月。微量透析技术在神经肿瘤学中的应用是对GBM患者免疫监测的补充，具有良好的应用前景。早期使用脑微透析主要针对神经损伤或蛛网膜下腔出血患者，证明了该技术的安全性和可行性。目前利用细胞因子微透析对复发性GBM患者进行免疫监测的研究(NCT03493932)正在进行。

综上，GBM是一种高度恶性的疾病，目前尚无有效治疗手段，因此，寻找新的治疗策略迫在眉睫。近年来对GBM的发病机制及其与宿主关系的研究取得了巨大进展。随着对免疫功能的系统和肿瘤微环境的深入了解，为肿瘤的治疗提供了新的靶点。此外，对每个患者特定疾病的深入了解可能有助于改善患者的分类，从而确定最佳的新疗法。目前正在开发的多种免疫治疗策略具有越来越大的潜力，有望从根本上改变GBM患者的治疗方式。