天然紫草素衍生物SYUNZ-7对肿瘤的作用效果及机制

邓必勇 邓必祥

(贵州省骨科医院骨外科，贵州 贵阳 550002)

祖国传统医学治疗恶性肿瘤具有独特的优势，其中紫草为紫草科草本植物，有悠久的药用历史，主治血热毒盛、麻疹不透、湿疹、烫伤等。近年随着对紫草研究的深入，已明确紫草主要成分是紫草素、紫草宁和其衍生物萘醌类化合物〔1〕。现代药理学证明紫草素有多种生物活性，如抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗甲状腺亢进、降血糖、抗免疫低下等，对多种肿瘤细胞有确切的促凋亡和抑制生长的效果〔2〕。有研究证明紫草分离物有抗人癌细胞ECA-109、MGC-803的作用，紫草萘醌类衍生物可浓度依赖性的抑制多种前列腺癌细胞增殖〔3〕。但天然的紫草类化合物存在毒性大或抗瘤作用达不到理想结果等不足，仍没有在临床上应用。为了增强其抗肿瘤作用及降低毒副作用，黄志纾等〔4〕合成紫草素萘醌类衍生物，并证实半合成的紫草类衍生物抗肿瘤作用高于天然紫草类化合物。SYUNZ-7是由紫草素天然分离物β-二甲基丙烯阿卡宁基础上进行改造得到〔5〕，本研究拟探讨天然紫草素衍生物SYUNZ-7对肿瘤的作用效果及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及瘤株 昆明种小鼠(清洁级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK军2002-001)，体重20～24 g，雌雄各半。BALB/c裸小鼠，4～5周龄，雌雄各半(SPF级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号N0003915)。小鼠移植性肿瘤艾氏腹水癌(EAC)、人骨肉瘤细胞株MG-63、人肺癌细胞株GLC-82、人口底癌细胞株KB、人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株MGC-803均来源于贵州医学院第一附属医院研究所。

1.2试剂、仪器和样品 SYUNZ-7由贵州大学化学化工学院改造，在临床应用前需先进行溶解，可用二甲基亚砜(DMSO)处理，再通过双蒸水稀释。噻唑蓝(MTT)由上海益启生物科技有限公司生产，羟基喜树碱为黄石李时珍药业集团武汉李时珍药业有限公司。第Ⅷ因子相关抗原抗体为上海臻科生物科技有限公司生产。BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪为美国BD Biosciences生产，model 550 Microplate reader为(美国)赛默飞/Thermo Fisher产品。

1.3MTT法〔6〕检测SYUNZ-7的抗瘤作用 在96孔板上接种以上5种对数生长期的肿瘤细胞，每孔0.195 ml，培养4 h，再分别在每孔中将0.39～25.00 μg/ml 5 μl的SYUNZ-7加入，继续培养3 d。实验结束前4 h在每孔中加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，测定前弃去培养液，每孔加入0.1 ml的DMSO。每孔的吸光度(A)值通过Thermo Fisher550酶联免疫检测仪在570 nm波长下进行检测。根据抑制率=(1-用药组平均A值/对照组平均A值)×100%公式求出增殖抑制率，半数抑制浓度(IC50值)通过医学统计集法计算程序可求。

1.4抗小鼠移植性肿瘤 根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》〔7〕进行试验，在无菌条件下抽取小鼠肿瘤EAC细胞，再用氯化钠溶液进行稀释，稀释成2.5×107个/ml。在每只昆明种小白鼠右腋皮下接种0.2 ml，并随机分为1、2、4、8 mg/kg不同剂量的SYUNZ-7组、 羟基喜树碱阳性药物(HCPT)对照组(4 mg/kg)、15%DMSO溶液对照组、生理盐水对照组各10只，雌雄各半。在瘤株接种24 h后进行腹腔注射给药，1次/2 d，共5次。给药完成后的第2日处死小鼠，称体重，分离瘤块称重，抑瘤率=(1-用药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%，重复测量2次，取平均值。

1.5抗人癌裸鼠移植瘤实验 把体外培养对数生长期的MG-63细胞制成单细胞悬液，细胞密度为1×107个/ml，在每只BALB/c裸小鼠右腋皮下接种0.2 ml，待肿瘤生长可以度量时，游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b)。体积=(π/6)×〔(a+b)/2〕3。后根据肿瘤的大小随机将BALB/c裸小鼠分为1、2、4 mg/kg不同剂量的SYUNZ-7组、 HCPT对照组(5 mg/kg)、15%DMSO溶液对照组、生理盐水对照组各10只，雌雄各半。再进行腹腔注射给药，1次/3 d，共7次。实验完成时处死小鼠，称体重，并将瘤块剥出来称重，抑瘤率同1.4，重复测量2次，取平均值。

1.6流式细胞仪检测 收集不同时间(24、48、72、96 h)处理的MG-63细胞和不同浓度(1.56、3.12、6.25 μg/kg)处理的SYUNZ-7，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次后以70%浓度的乙醇固定并过夜，采用10 μmol/L碘化丙啶进行细胞染色，染色5 min，低温避光0.5 h，采用流式细胞仪检测DNA含量，BectonDickinson公司LYSIS软件进行分析。

1.7免疫组化法 在上述裸小鼠实验完成时，用10%甲醛溶液固定1、2、4 mg/kg不同浓度的SYUNZ-7组、HCPT对照组、15%DMSO溶液对照组、裸小鼠NS对照组的肿瘤组织标本，石蜡包埋，3 μm切片。在到0.01 mol/l pH为6.0的枸橼酸缓冲液中置入脱蜡、水化、封闭处理好的切片。滴加第一抗体兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体20 μl，稀释成1∶200浓度，4℃孵育过夜，PBS洗涤。滴加生物素标记的第二抗体，37℃孵育0.5 h，PBS洗涤，滴加过氧化物酶标记链霉素抗生物素蛋白，37℃孵育0.5 h，洗涤，二氨基联苯胺(DAB)显色，后常规冲洗，复染，封片，显微镜观察。根据Weidner等〔8〕报道的检测方法测定肿瘤微血管密度(MVD)。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1SYUNZ-7体内抗肿瘤及体外抗增殖活性作用

2.1.1SYUNZ-7对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用 经MTT法测得结果显示，SYUNZ-7对MG-63、GLC-82、HepG2、KB、MGC-803细胞的IC50值分别为(4.15±0.07)μg/ml、(2.17±0.03)μg/ml、(9.98±0.22)μg/ml、(5.42±0.01)μg/ml、(6.42±0.15)μg/ml，提示SYUNZ-7可抑制多种肿瘤细胞增殖，并呈现浓度依赖性，见表1。

表1 SYUNZ-7对多种肿瘤细胞的增殖抑制率

-代表无抑制率；表2同

2.1.2SYUNZ-7人骨肉瘤MG-63细胞裸小鼠移植瘤生长的抑制作用 1、2、4、8 mg/kg SYUNZ-7对小鼠EAC(实体型)的抑瘤率分别为(40.4±0.2)%、(50.8±2.2)%、(61.2±1.9)%、(65.5±7.2)%。随着SYUNZ-7剂量的增加对MG-63细胞裸小鼠移植瘤的抑瘤率增高，见表2。

表2 SYUNZ-7人骨肉瘤MG-63细胞裸小鼠移植瘤生长的抑制作用

与NS组比较:1)P<0.05;与15%DMSO组比较:2)P<0.05；3)死亡2只

2.2SYUNZ-7诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡 经流式细胞仪分析得，MG-63细胞经6.25 μg/ml SYUNZ-7处理24、48、72、96 h和2%DMSO处理72 h的凋亡率分别为27.9%、58.2%、65.0%、71.5%、1.2%。MG-63细胞经1.56、 3.12、6.25、12.50 μg/ml SYUNZ-7处理72 h的凋亡率分别为11.8%、68.1%、70.4%、51.4%。提示SYUNZ-7可浓度依赖性及时间依赖性诱导MG-63细胞凋亡，但是经12.5 μg/ml SYUNZ-7处理的MG-63细胞72 h凋亡率低于6.25 μg/ml SYUNZ-7处理的，可能和长时间及浓度高药物处理引起MG-63细胞溶解及坏死相关。

2.3SYUNZ-7对MG-63细胞周期的作用 随着 SYUNZ-7处理浓度的增加或作用时间的延长，MG-63细胞G2/M期细胞比例降低，S期细胞比例上升，提示 SYUNZ-7对MG-63细胞S期至G2/M期转化有阻滞作用，见表3、4。

表3 6.25 μg/ml SYUNZ-7作用MG-63细胞的周期分布(%，n=5)

表4 不同剂量SYUNZ-7作用MG-63细胞的周期分布(%，n=5)

2.4SYUNZ-7对MG-63细胞裸小鼠移植瘤血管生成的作用 1、2、4 mg/kg SYUNZ-7组的MVD值分别为(20.1±2.8)条/每视野、(15.8±2.6)条/每视野、(13.5±1.7)条/每视野。15%DMSO溶液对照组、羟基喜树碱阳性对照组、生理盐水对照组MVD分别为(27.0±2.3)条/每视野、(16.4±2.0)条/每视野、(25.2±2.8)条/每视野。SYUNZ-7各浓度组肿瘤组织中的MVD值均低于15%DMSO溶液对照组、生理盐水对照组(P<0.05)，提示SYUNZ-7可抑制人骨肉瘤MG-63细胞裸小鼠移植瘤血管的生成。

3 讨 论

本研究提示SYUNZ-7有较强的细胞毒作用，临床上对于GLC-82、HepG2、MG-63、KB人癌细胞的研究鲜有报道〔9〕。天然紫草萘醌衍生物天然紫草萘醌衍生物93/637(SA)及萘醌化合物LⅢ对体外培养的DU145、PC-3、ECA109等人癌细胞有强细胞毒作用〔10〕。表明无论是紫草萘醌衍生物或化合物均对多种人癌细胞有抗癌活性。而关于体内抗瘤作用研究，国内外临床上相关研究较少，较为典型的是赵守先〔11〕报道显示紫草提取物紫草素A可抗小鼠移植肿瘤S-180、EAC。本研究结果提示，在不同剂量下SYUNZ-7对小鼠EAC(实体型)的抑瘤率均高于30%，且呈剂量依赖性抑制。2、4 mg/kg SYUNZ-7对MG-63细胞裸小鼠均有明显的抑瘤率。

细胞凋亡在肿瘤的发生、进展及退化过程中有重要作用，在大多数肿瘤组织中均存在细胞凋亡〔12〕。研究报道，新疆紫草素对大肠癌细胞凋亡有诱导作用〔13〕。本研究结果也证实SYUNZ-7对MG-63细胞凋亡有诱导作用，使细胞周期停滞在S期，但具体通过什么途径调节肿瘤细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡，临床尚未阐明，本实验也未深入探讨。但紫草素对恶性黑色素瘤A375-S2细胞周期研究中发现存在细胞周期调控因子细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)4活性降低及P53活性异常增高〔14〕。而Caspase-3激活是紫草衍生物紫草衍生物β-羟基异戊酰紫草素(β-HIVS)对HL-60细胞凋亡的诱导作用机制之一〔15〕。提示紫草素萘醌衍生物或化合物调控细胞周期因子活性与调节细胞周期及诱导细胞凋亡作用密切相关〔16〕。而关于SYUNZ-7对MG-63细胞凋亡的诱导作用有待深入探讨。新生血管和肿瘤细胞的生长、增殖也有重要作用，肿瘤的复发、转移及分化和新生血管的密度密切相关〔17〕。MVD是临床上反映肿瘤血管生成的常用客观指标，既往研究报道，紫草素对B16黑色素瘤的血管生成及内皮细胞的增殖和转移有抑制作用〔18〕。本研究表明SYUNZ-7可抑制人骨肉瘤MG-63细胞裸小鼠移植瘤血管的生成。综上，天然紫草素衍生物SYUNZ-7体内外抗瘤作用较强，其抗瘤作用机制可能和抑制肿瘤血管生成、阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡相关，从而可抑制肿瘤细胞DNA合成及肿瘤细胞增殖。本研究仅为一个初步试验，日后可增加毒性试验及瘤谱试验进行多作用靶点的研究。