14-3-3ζ蛋白在肝细胞癌发生发展中的作用及研究进展

简如丽，刘霆

（中南大学湘雅医院 消化内科，湖南 长沙 410008）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的消化道肿瘤之一，我国所有癌症中，HCC的发病率居于第4位，病死率居于第3位[1]，研究探索HCC新的诊断、筛查、治疗及预测预后的生物学靶点十分重要。HCC的发生发展涉及细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和组织微环境的改变等多种过程[2]。14-3-3ζ蛋白作为参与多种信号转导通路的枢纽蛋白，已被证实在HCC中存在过表达。作为致癌基因，14-3-3ζ的过表达可激活下游分子并激发HCC细胞的恶性潜能[3]。越来越多的证据表明14-3-3ζ在HCC的诊断、预后和化疗耐药性方面具有重要作用[4-5]。最近，Lin等[6]通过生物信息学分析，研究了14-3-3ζ在mRNA水平上对HCC的作用，他们发现14-3-3ζ在HCC癌组织和细胞系中表达升高，另外，靶向14-3-3ζ的microRNA表达水平与HCC患者预后改善存在相关性，这提示14-3-3ζ蛋白可能成为HCC的治疗靶点。因此，14-3-3ζ蛋白作为一种重要的癌症相关蛋白，在HCC的诊断、预后、化疗耐药性和治疗等方面展现出越来越大的潜力，值得深入研究探索。

1 14-3-3ζ蛋白的生物学功能

1.1 14-3-3蛋白家族概要

1967年，Moore等[7]从牛脑匀浆中首次发现14-3-3蛋白。经过几十年的研究，对14-3-3蛋白的不同靶点及其细胞功能取得了较深的认识。14-3-3蛋白家族是真核细胞表达的高度保守调控分子，分子质量约为30 kD，共有7种亚型（β、γ、ε、ζ、η、σ、τ），分别由7种不同的基因编码[8]，主要以同源/异源二聚体形式存在于细胞质内，二聚体状态通常比较稳定，Ser58的磷酸化会打破14-3-3蛋白单体和二聚体之间的平衡，导致二聚体的进一步解离和单体的蓄积，这可能会破坏细胞内稳态，导致14-3-3靶向通路的激活,从而导致癌症的发生[9]。14-3-3蛋白缺乏蛋白酶活性，其与丝氨酸/苏氨酸磷酸化的胞内蛋白相互作用，通过改变构象、影响蛋白活性及复合物的稳定性或改变亚细胞定位等多种方式调控靶蛋白，从而参与细胞信号转导、细胞周期调控、增殖代谢、凋亡及细胞表型转化等多种生理过程[10]。研究[11]表明14-3-3蛋白在神经系统疾病、关节炎症、恶性肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病等中均扮演了重要角色。

1.2 14-3-3ζ蛋白的功能

在14-3-3蛋白家族中，14-3-3σ蛋白发挥肿瘤抑制作用,ζ、β、γ这3种亚型在HCC的发生发展中发挥促进作用[12]。其中，14-3-3ζ蛋白可结合包括晶状体蛋白（αB-crystallin）、丝切蛋白、BAD、激酶、磷酸酶等在内的多种蛋白质，是信号通路中重要的接头蛋白，参与多种生理活动的调节。14-3-3ζ蛋白在心脏疾病及中风中可通过与血小板受体糖蛋白GPIb-IX-V形成复合体发挥抗血小板作用[13]。研究发现，哺乳动物14-3-3的7种亚型中，仅14-3-3ζ与代谢相关，在敲除14-3-3ζ小鼠中通过增加胰高血糖素样肽1（GLP-1）水平增强口服葡萄糖耐量，调节葡萄糖稳态[14]。14-3-3ζ蛋白也参与了神经退行性疾病的发展[15]。此外，14-3-3ζ蛋白是目前广为关注的新的抗肿瘤靶点，不仅在HCC、食管癌、乳腺癌、非小细胞肺癌中表达水平均显著升高，且作为多种癌症诊断、复发、预后和化疗耐药性的潜在生物标志物被广泛研究[5]。

2 14-3-3ζ蛋白对HCC发生发展的影响

2.1 14-3-3ζ蛋白在HCC中的表达

多项研究[4，16-17]表明，HCC的发生发展与14-3-3ζ蛋白的异常表达密切相关，14-3-3ζ蛋白在HCC癌组织中的表达显著高于癌旁组织，与HCC细胞的浸润转移、化疗耐药性及不良预后等具有相关性。Tang等[18]研究发现，在HCC细胞中，14-3-3ζ蛋白可与乙型肝炎病毒蛋白X（hepatitis B virus protein X，HBx）结合并维持其蛋白稳定性，Akt通路的激活参与了14-3-3ζ与pSer31-HBx之间的相互作用，且基因敲除14-3-3ζ的表达可抑制HBx的表达，提示14-3-3ζ可以作为治疗HBV相关HCC的潜在靶点。另一研究[19]发现，缺氧条件下HCC细胞中14-3-3ζ的稳定高表达是由于14-3-3蛋白的泛素化水平下降。Liu等[4]发现，在HCC患者中存在抗14-3-3ζ的自身抗体，并且在临床确诊HCC之前可以通过蛋白印迹观察到血清中与14-3-3ζ的强的反应条带，抗14-3-3ζ的自身抗体可能是HCC的早期筛查和早期诊断潜在的生物学标记物。HCC中存在14-3-3ζ蛋白的过表达，并且通过RNA干涉技术沉默或下调14-3-3ζ蛋白可抑制HCC细胞的增殖[16]。因此，14-3-3ζ蛋白的过表达在HCC的进展中具有重要意义。

2.2 调控HCC细胞的增殖

14-3-3ζ蛋白在调控HCC细胞增殖方面有着重要的作用。14-3-3ζ蛋白可以与调节细胞增殖的因子相互作用，激活相应信号通路，促进癌细胞过度增殖，最终导致肿瘤的发生发展[11]。

2.2.1 14-3-3ζ/血红素氧合酶-1/STAT3通路血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是一种应激诱导的细胞内限速酶，HO-1及其酶产物在维持细胞内环境稳定和调节氧化应激、炎症、细胞增殖与凋亡、纤维化和血管生成等生物学过程中具有重要作用。研究发现14-3-3ζ是新型的HO-1结合蛋白，二者的结合可抑制HO-1的泛素化和蛋白酶体介导的降解，从而促进了HO-1的稳定，过度的HO-1显著增强IL-6诱导的STAT3活化，STAT3是一种重要的转录激活因子，调控多种基因的表达，这些基因对细胞分化、增殖、凋亡、血管生成和转移至关重要，STAT3活性的失调与HCC的发生密切相关[20]，14-3-3ζ/HO-1轴可通过STAT3通路的调控作用于肝细胞增殖，导致HCC的发生发展[21]。

2.2.2 14-3-3ζ与PI3K-Akt协同促进HCC进展14-3-3ζ诱导PI3K/Akt信号通路活化在HCC的发生发展中具有重要作用。Tang等[22]对HCC及邻近肝组织行组织芯片检测发现HCC患者中14-3-3ζ蛋白水平过表达，与P-Akt水平呈正相关性，并加速HCC异种移植肿瘤的生长和体内诱导P-Akt/低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达。14-3-3ζ诱导Akt信号通路激活，导致HCC细胞增殖和存活，从而导致HCC的进展。另外，14-3-3ζ和P-Akt的共同上调与卫星结节、微血管浸润、门静脉癌栓相关，提示HCC患者预后不良。

另一研究表明通过RNA干涉技术抑制14-3-3ζ蛋白从而抑制HepG2 HCC细胞增殖，14-3-3ζ蛋白表达的减少可降低Huh-7细胞的致瘤性。此外，沉默14-3-3ζ蛋白可通过JNK和p38信号通路影响HCC细胞对化疗药物的敏感性，14-3-3ζ蛋白具有多方面的作用[16]。

2.3 调控HCC细胞迁移和侵袭

2.3.1 14-3-3ζ促进上皮间质转化发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指细胞从上皮细胞通过特定的程序向间质细胞表型转化的生物学过程[23]。在此过程中，上皮细胞失去了包括细胞极性及与基底膜的连接等表型，并获得了迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等能力[24-27]。研究表明，与许多其他癌细胞一样，HCC细胞可通过EMT获得间充质特性，随后癌细胞脱离原发病灶后侵入血管并在远处定植形成转移性病灶[28]。

近年来有一些学者发现14-3-3ζ蛋白可以通过以下机制来促使HCC中的EMT的发生：⑴ Huang等[29]研究发现αB-crystallin与14-3-3ζ结合成复合物后增强了14-3-3ζ的稳定性，并通过Erk1/2/Fra-1/slug信号通路激活诱导EMT过程，从而促进HCC的转移复发，并导致索拉菲尼耐药性的增加；⑵ Axl是一种受体酪氨酸激酶，Reichl等[30]发现在HCC细胞中Axl/14-3-3ζ可导致Smad3L异常磷酸化和激活TGF-β肿瘤促进靶基因，诱导TGF-β自分泌，导致EMT转化水平上调，促使HCC细胞发生转移，且HCC患者中Axl/14-3-3ζ的表达与血管侵犯和不良生存期相关；⑶ 缺氧诱导14-3-3ζ/HIF-1α/EMT通路。缺氧在HCC等实体肿瘤中很常见，Tang等[31]研究发现，在HCC细胞中缺氧诱导14-3-3ζ表达升高，与门静脉癌栓形成相关，此外，14-3-3ζ可通过招募HDAC4上调HIF-1α表达，体外缺氧条件下，敲除14-3-3ζ可通过HIF-1α/EMT通路抑制缺氧诱导的侵袭。缺氧/14-3-3ζ/ HIF-1α通路在门静脉癌栓的形成和HCC的发生发展中发挥着重要作用，且14-3-3ζ和HIF-1α的高表达是HCC患者预后不良的强有力的预测因子。因此，14-3-3ζ促进EMT的发生的机制并不是单一的。

2.3.2 14-3-3ζ/磷酸化的Akt/FOXO3a通路一项研究表明，14-3-3ζ的高表达增强了Akt的磷酸化，磷酸化的akt主要通过促进FOXO3a的磷酸化并与14-3-3ζ结合来抑制FOXO3a的活性，进一步促进磷酸化FOXO3a的核输出，进而促进HCC细胞的侵袭和迁移。分子研究证实14-3-3ζ是miR-22的直接靶点，miR-22可通过抑制14-3-3ζ表达抑制其介导的AKT磷酸化促进FOXO3a的核积累，进而抑制HCC细胞迁移和侵袭，从而增强FOXO3a在HCC中的抗肿瘤活性[32]。

综上所述，14-3-3ζ的高表达导致的Akt信号通路激活，可引起HIF-1α高表达及磷酸化FOXO3a的核输出，造成HCC的增殖及侵袭和迁移，但具体何种信号通路发挥主要作用，何种通路可成为抑制HCC进展的主要靶点，还有待进一步研究。

2.4 抑制HCC细胞凋亡

肿瘤的发生是由于肿瘤细胞的失控生长与过度增殖，从细胞凋亡的角度看，则是肿瘤细胞的各种凋亡机制受到抑制的结果。在细胞的凋亡过程中，14-3-3ζ以二聚体的形式与不同的靶蛋白结合，调控其定位和功能。

2.4.1 14-3-3ζ降低HCC的化疗敏感性Choi等[16]研究发现在HCC中14-3-3ζ可通过调节c-Jun-NH(2)端激酶和p38/MAPK通路来影响顺式二胺二氯铂（cis-diammined dichloridoplatium，CDDP）的化学敏感性，结果显示沉默14-3-3ζ可以抑制HCC生长并增强对CDDP的化学敏感性，从而增加肝HCC细胞凋亡。

2.4.2 14-3-3ζ的下调增强辐射诱导的细胞凋亡另一研究[17]发现，通过抑制14-3-3ζ可以抑制细胞活力，并通过与Bax的相互作用增强辐射诱导的细胞凋亡，从而降低辐射耐药性，肝脏肿瘤干细胞样细胞（cancer stem-like cells，CSCs）中14-3-3ζ的下调可能会增加对γ放射(γ-irradiation，IR)的敏感性，并在IR暴露后显著降低细胞存活率，在14-3-3ζ被敲除后，CSCs中IR后细胞凋亡率增加，从而导致抗辐射能力下降；此外，14-3-3ζ敲除增强了辐射诱导的细胞凋亡，在肝脏CSCs中存在大量裂解的细胞凋亡蛋白酶3和Bax。因此，14-3-3ζ可能通过抑制细胞凋亡相关促进分子如Bax的功能，从而抑制细胞凋亡，导致HCC的发生发展。

2.4.3 14-3-3ζ与ASK1作用抑制HCC细胞凋亡有报道[12]表明14-3-3蛋白家族可与ASK1相互作用而抑制HCC细胞凋亡。ASK1是一种促分裂原活化蛋白激酶，它的激活可导致JNK和p38介导的MAPK信号级联的发生，从而促进细胞凋亡的发生。ASK1可通过Ser-967与14-3-3ζ特异性相互作用，将ASK1隔离在细胞质中，使其促凋亡功能受到抑制，促进HCC的发生发展。

2.4.4 14-3-3ζ降低肿瘤浸润淋巴细胞在HCC中的抗肿瘤活性HCC的恶性程度高，进展快。Wang等[33]认为在HCC中，14-3-3ζ的表达上调可通过抑制肿瘤浸润T细胞的抗肿瘤功能来促进HCC的浸润转移，他们研究结果显示，在HCC细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TILs）中均存在14-3-3ζ的高度表达，且二者成正相关；与14-3-3ζ低表达组相比，14-3-3ζ高表达组的T细胞衰竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG3、CTLA-4）的表达水平更高，这表明14-3-3ζ可导致CD8+T细胞的耗竭，这一发现证明了14-3-3ζ蛋白可降低TILs在HCC中的抗肿瘤活性。因此，HCC中14-3-3ζ蛋白可以通过抑制肿瘤免疫微环境中的T淋巴细胞抗肿瘤效应来促进HCC的发生发展，但是该机制的研究太少，还需要更多的实验来进一步的验证。

3 总结及展望

HCC是肝脏最常见的恶性肿瘤，是癌症相关死亡的主要原因之一[34]，病死率高，预后差[35]。14-3-3ζ作为肿瘤相关蛋白，在HCC中高度表达。14-3-3ζ蛋白可与αB-crystallin、HO-1、Bax、Axl等蛋白分子相互作用，可诱导p-Akt/HIF-1α、c-Jun-NH(2)端激酶和p38/MAPK通路、ASK1等信号通路，作为几个信号级联的中心枢纽参与HCC的增殖、凋亡、侵袭、转移和治疗耐药，从而促进HCC的发生发展。本文所述研究提示14-3-3ζ蛋白可能成为HCC的治疗靶点，但目前仅有针对14-3-3蛋白的多肽抑制剂如R18和R18的二聚体（difopein)，但是由于缺乏亚型特异性，其在临床上的应用受到了限制[36-37]。另外，可通过RNA干涉或反义RNA靶向14-3-3ζ，使其沉默或降解，从而达到抑制肿瘤目的，但存在脱靶效应[38]。目前也有关于14-3-3蛋白与靶蛋白相互作用的抑制剂BV02[39]以及14-3-3与配体相互作用的稳定剂如壳梭孢素A[40]和环孢素A[41]等的研究。但直到目前为止，关于14-3-3ζ蛋白靶向治疗的研究仍不成熟，仍需解决如14-3-3ζ抑制剂的载体及亚型特异性的药物等诸多问题。14-3-3ζ蛋白在HCC中的作用使其有望成为早期筛查和诊断的潜在的生物学标记物以及复发转移及生存分析的临床预后标记物，但其作为一种独立的生物标志物的特异性和敏感性也有待进一步研究。通过探索14-3-3ζ在HCC中的多种作用机制，期许研发出特异的抑制14-3-3ζ生物学功能的药物，为HCC的治疗提供新的选择。综上所述，当前的研究表明14-3-3ζ在HCC的发生发展中发挥着重要的作用。14-3-3ζ蛋白在HCC的诊断、预后、化疗耐药性和治疗靶点方面显示出越来越大的潜力，具有重要的研究意义。期待能够通过对14-3-3ζ蛋白在HCC发生发展中的作用机制的研究来进一步寻找可能的药物治疗靶点，从而为HCC患者的诊断治疗提供新的选择，使HCC患者获得更好的临床预后。