免疫组织化学检测在胸水液基细胞学中的可行性研究

金晶晶，殷于磊，顾 晏，苏敏君，肖 立

复旦大学附属华东医院病理科，上海 200040

胸水是肿瘤和非肿瘤疾病的常见临床表现，其性质的判断对临床诊断治疗有重要意义。传统的细胞学方法是胸水离心后的沉淀物涂片，近年来液基细胞学（liquid-based cell test，LCT）技术的应用，提高了细胞学制片质量，更易于光镜观察细胞形态。随着医学科学的进步，单纯的细胞形态学诊断已无法满足临床诊断治疗的需求［1-2］，免疫组织化学和分子检测已经成为必要的辅助手段，离心后细胞学包块是常用方法之一，但相对耗时、肿瘤细胞较少时容易丢失。本研究运用LCT制片技术，直接行胸水细胞学免疫组织化学检测和观察，鉴别反应性间皮细胞与肿瘤细胞，并确定肿瘤细胞组织来源，探讨其临床应用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

回顾性分析复旦大学附属华东医院病理科2016—2017年间在胸水中找到脱落细胞的病例，收集其中96例标本，诊断为找到癌细胞、存在异型上皮细胞巢、可能为反应性间皮细胞。

1.2 方法

1.2.1 H-E染色片及白片的制备

使用美国BD公司的PrepStain全自动液基细胞制片机。前期标本处理方式：①收到的胸水标本振荡均匀祛除凝块、微粒及黏液，再将样本转移至50 mL离心管，放入离心机并以600×g的转速离心10 min，倒掉上清液，保留下层的细胞沉积物。若胸水标本量多可以重复离心后并管。② 在离心管中加入15 mL CytoRich红色固定液，振荡后放置至少30 min，放入离心机，以600×g的转速离心10 min，倒掉上清液并振荡。③如果未见或仅见少量的细胞沉淀，加入10 mL蒸馏水振荡后全部转移到12 mL离心管内；如果见较大或很大的细胞沉淀，将部分标本（吸取1～5滴）转移到12 mL离心管内，并加入10 mL蒸馏水。将离心管放入离心机，以600×g的转速离心5 min，倒掉上清液并振荡。④ 将贴上标签的12 mL离心管放到PrepStain全自动液基细胞制片机上进行自动制片。⑤ 根据制片程序制成多张白片及H-E染色片一张。将制备完成的白片放入95%的乙醇中使其保持湿润状态。

1.2.2 免疫组织化学检测

将全自动液基细胞制片机上制备的白片进行免疫组织化学染色。免疫组织化学所用抗体甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1）、P63、WT1、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、CK7、CK20、CDX2、CA19-9、P53、PAX2、TG为购自丹麦DAKO公司及福州迈新生物技术开发有限公司的即用型抗体，采用丹麦DAKO公司的Autostainer Link48全自动免疫组织化学机进行免疫组织化学染色，采用EnVision两步法。

2 结果

2.1 临床资料和薄层细胞学H-E染色

96例患者，男性57例，女性39例，平均年龄72.9岁（46～95岁）。39例无明显阳性病史而以胸水为首发症状，10例有肺癌病史或影像学显示肺内占位性病灶，3例有乳腺癌切除病史，4例有结肠腺癌切除病史，2例有胰腺导管腺癌病史，1例有胃腺癌病史，1例甲状腺滤泡癌复发二次手术病史，1例有卵巢浆液性癌病史，1例有前列腺癌病史，其余病例有心衰、慢性肾功能衰竭等良性病变病史。经细胞学检查明确找到癌细胞的有39例，其中倾向腺癌细胞31例，倾向鳞状细胞癌2例，低分化癌需分型6例；肿瘤性细胞与反应性间皮细胞需鉴别17例；倾向反应性间皮40例。

2.2 薄层细胞学免疫组织化学检测结果

LCT白片进行免疫组织化学染色，最终诊断癌46例，反应性间皮43例，仍不确定是反应性间皮或肿瘤细胞的有7例（表1）。在46例诊断癌细胞病例中，TTF-1阳性而明确肺腺癌的有19例（图1），占恶性病例的59.3%，其中1例同时有结肠癌病史，TTF1（+）/CDX2（-）。P63/P40阳性的鳞状细胞癌3例（图2）。CDX2染色阳性的转移性结肠癌2例（图3）。CA19-9阳性的胰腺癌2例（图4）。TTF1/TG染色阳性的转移性甲状腺滤泡癌1例（图5）。ER/PR/HER2阳性染色的转移性乳腺癌3例，其中1例患乳腺癌4年（原发），ER/PR/HER2均为（3+），胸水细胞学为ER（2+）/PR（-）/HER2（3+）；另外2例乳腺癌病史分别为5、11年，原发肿瘤免疫标志不详，胸水细胞学为ER（3+）/PR（-）/HER2（3+）及ER（+）/PR（+）/HER2（-）（图6）。WT1（+）/P53（+）/ER（+或-）/PAX2（+）染色的转移性卵巢浆液性癌2例（图7），其中1例以胸水为首发症状，经胸水诊断后发现盆腔肿块。14例腺癌或低分化癌细胞无法判断来源，原因是病史不明确、异型细胞量少且在免疫组织化学片内消失或肿瘤细胞脱片、所选的器官特异性抗原均不表达。7例经免疫组织化学染色无法区分反应性间皮细胞和癌细胞，原因是间皮和其他特异性上皮标志均不表达、细胞量有限且无法再次提取细胞，建议临床结合病史和影像学检查再次送检细胞学或取组织活检。43例明确反应性间皮细胞TTF1（-）/P63（-）/WT1（+）（图8）。6例肺腺癌诊断后剩余胸水送检EGFR基因突变检测，其中3例存在基因突变阳性，且均为L858R突变。

表1 细胞学免疫组织化学并结合临床病史的诊断结果Tab.1 Diagnosis resulted from cytological immunohistochemistry and clinical history n(%)

图1 肺腺癌细胞学诊断Fig.1 Lung adenocarcinoma detected by cytological diagnosis

图2 鳞状细胞癌细胞学诊断Fig.2 Squamous cell carcinoma detected by cytological diagnosis

图3 结肠腺癌细胞学诊断Fig.3 Colon adenocarcinoma detected by cytological diagnosis

图4 胰腺导管腺癌细胞学诊断Fig.4 Pancreatic ductal adenocarcinoma detected by cytological diagnosis

图5 甲状腺滤泡癌（二次手术复发后）的细胞学诊断Fig.5 Thyroid follicular carcinoma (recurrence after the second surgery) detected by cytological diagnosis

图6 乳腺癌病史、原发肿瘤免疫标志不详的胸水细胞学检查Fig.6 Cytology of pleural exfoliation with a history of breast cancer,without immunostaining result in primary tumor

图7 浆液性癌的细胞学诊断Fig.7 Serous carcinoma detected by cytological diagnosis

图8 反应性间皮细胞免疫组织化学WT1阳性Fig.8 WT1 positive expression in reactive mesothelial cells detected by immunohistochemistry (EnVision,×200)

3 讨 论

体液脱落细胞学是临床病理学检查常用的方法之一，近年来自动化的LCT制片技术的广泛应用，确保了提取足够量的细胞、背景干净、细胞分布均匀、结构清晰，提高了制片质量，尤其是在脱落的肿瘤细胞少、背景中有较多炎症细胞或黏液时，LCT的前处理可充分发挥其优势，提高肿瘤细胞的检出率和诊断分型的准确率［3-4］。

体液脱落细胞学标本包括胸水、腹水、心包等，其中胸水标本更常见，恶性胸水中多数是肺癌，部分是其他组织器官来源的癌，肺癌以TTF1阳性腺癌常见，本文研究中占59.3%，有限的免疫组织化学抗体可以解决大多数诊断问题。而腹水、心包积液临床状况复杂、恶性细胞往往缺乏器官特异性标志，常需要更多免疫组织化学抗体标志。LCT虽然省时、便捷，但制片数量有限、制片成本较高，更合适运用于相对简单的胸水免疫组织化学，而腹水、心包积液用包块检查相对经济，可以提供更多检查方法。

LCT制片利用自然沉降，固定液中可保存30 d，细胞形态保持良好，在标本量足够时，还可制备至少6～8张质量相同的细胞学白片，可以利用白片进一步做特殊染色或免疫组织化学检查，补充形态学观察的局限性。此外，我们还利用了多余细胞进行EGFR分子检测，得到了良好的DNA质量和检测结果，无需细胞包块过程，为患者提供了快速精准的诊断治疗依据。

相比于细胞学包块检查，直接的细胞学白片快捷、便利，避免了细胞学包块因离心不足、黏液较多或肿瘤细胞少时收集到的细胞量的不足，同时也能获得良好染色效果，但缺点是固定时间有限，不能永久保存，因此需要一次性全面足够检测所有诊断治疗相关项目，并无法用于回顾性科研、进一步其他类型的检测［5］。

尽管LCT制片质量较好，但有时增生或退变的间皮细胞不易与腺癌细胞鉴别，易造成假阴性或假阳性诊断［6］，同时，胸水诊断恶性时，如果明确恶性肿瘤的组织器官来源，可以帮助临床医师制定进一步的治疗方案。我们尝试直接细胞学白片进行免疫组织化学检测，帮助判断反应性间皮、肿瘤细胞及肿瘤来源。我们的研究表明，大多数病例经免疫组织化学染色可以明确诊断，并结合临床病史判定肿瘤来源。仍有少量病例虽经免疫组织化学染色，因剩余细胞量少、染色结果不佳或不表达任何器官特异性标志物等原因无法明确是否是肿瘤以及肿瘤的类型和来源，此类病例通常需要再次送检胸水标本或组织活检。

胸水中最常见的转移性肿瘤是肺腺癌，细胞核TTF1染色可以明确诊断，但除了肺腺癌，甲状腺癌也表达TTF1，因此临床病史（甲状腺乳头状癌或滤泡癌病史）、影像学检查非常重要，结合甲状腺球蛋白TG染色可以提供帮助。部分患者同时有多种肿瘤发生，胸水中鉴别是否是肺腺癌或其他肿瘤转移对临床治疗非常重要，TTF1染色提供了可靠的证据［7］。

P63是鳞状细胞癌的标志物，鳞状细胞癌常伴坏死、炎症反应，而脱落细胞的数量较少，散在的细胞核阳性比普通染色片更易发现肿瘤细胞，免疫组织化学是良好的辅助手段，当然，P63仅是鳞状细胞癌的标志物，无法区分肺原发性或转移性肿瘤，必须结合病史。

胸水中的乳腺癌转移除了提示临床有转移外，还需提供ER、PR、HER2状态为进一步治疗提供帮助。我们直接将液基细胞学制片进行免疫组织化学检查，结果良好，其中HER2的细胞膜强染色易于判断，可为临床靶向治疗提供依据。结直肠腺癌转移可用CDX2细胞核染色标志证实，胰腺癌可用CK7、CA19-9标志证实，而胃腺癌目前没有很好的器官特异性标志物。

WT1是我们常用的鉴别反应性间皮细胞核染色标志，同时也是卵巢浆液性癌的标志，因此，常规细胞学检查是基础，浆液性癌细胞学异型性大，结合P53、PAX2或8、ER等标志可以区分，当然参考临床病史和影像学检查结果可以明确诊断。另外，WT1也是恶性间皮瘤标志，间皮瘤有时在细胞学上很难与反应性间皮相区别，间皮瘤罕见，Desmin标志阳性有助于区分反应性间皮细胞［8］。

综上所述，LCT直接免疫组织化学染色方法在胸水脱落细胞学诊断中可行，虽然存在一定的局限性，但它仍是辅助诊断肺腺癌、鳞状细胞癌、明确部分转移性癌组织器官来源的可靠方法。