两种香青属植物挥发油的化学成分及抗肿瘤活性

张洪权，杨 英，佘嘉祎，刘雨琪，江婉秋，张 彬，邓樱花*，熊校勤*

1植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室；2湖北第二师范学院化学与生命科学学院，武汉 430205

香青(AnaphalissinicaHance)和黄腺香青车前叶变种(Anaphalisaureopunctatavar.plantaginifoliaChen)均为菊科(Compositae)香青属(AnaphalisDC.)植物，生于海拔1 000米以上的山坡和湿地[1]。香青具有镇咳、祛痰、抑菌等作用[2]，Hua等[3]对甘肃产香青挥发油的化学成分进行了分析，共鉴定出80种挥发性化学成分，关于香青挥发油的生物活性还未见文献报道。黄腺香青具有清热解毒、驱虫的功效，用于牙痛、痢疾、蛔虫病等症[4]。关于黄腺香青车前叶变种挥发油的化学成分及药理活性未见文献报道。本研究拟采用GC- MS结合保留指数对大别山产香青及黄腺香青车前叶变种全株挥发油的化学成分进行分析，并采用MTT法对其进行体外抗肿瘤活性测试，旨在为这两种香青属植物的进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

香青和黄腺香青车前叶变种采自于湖北省大别山，由湖北第二师范学院化学与生命科学学院戴月副教授鉴定为菊科香青属植物香青(AnaphalissinicaHance)和黄腺香青车前叶变种(Anaphalisaureopunctatavar.plantaginifoliaChen)，原植物标本(编号：20170723、20170724)现存于湖北第二师范学院化学与生命科学学院植物标本室。正构烷烃C7～C30(色谱纯)、甲基噻唑蓝(MTT)、顺铂(cisplatin)和D5796 DMEM培养基均为美国Sigma- Aldrich公司产品；胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher Scientific公司；四季青®胎牛血清为浙江天航生物科技股份有限公司生产；实验室用水为Milli- Q Integral 5型纯水仪生产的超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A- 5975C型气相色谱- 质谱联用仪，美国Agilent公司生产；Spectramax®plus384型多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司生产；3111型CO2培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司生产；IX51型倒置荧光显微镜，日本Olympus公司生产；SW- CJ- 2FD型超净工作台，苏净集团苏训安泰空气技术有限公司生产；YXQ- LS- 75S11型灭菌锅，上海博讯实业有限公司生产；Milli- Q Integral 5型纯水仪，德国Merck Millipore公司生产；挥发油提取器，江苏三爱思玻璃仪器有限公司生产。

1.3 供试细胞

肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株HeLa、肝癌细胞株HepG2和结肠癌细胞株HCT- 116购自上海中科院细胞库。

2 实验方法

2.1 挥发油的提取

参照2015版《中国药典·四部》通则2204挥发油测定法。称取粉碎过的香青和黄腺香青车前叶变种全株各200 g，置于5 L的圆底烧瓶中，加入3 L的超纯水，盖上瓶塞，浸泡3 h，提取约8 h，至测定器中油量不再增加，停止加热，静置冷却，收集挥发油。以油质量/样品质量计算香青和黄腺香青车前叶变种全株挥发油的提取率分别为0.87%和0.79%。

2.2 GC- MS分析条件

2.2.1 香青GC条件

进样口温度为250 ℃，进样量1 μL,分流比：30∶1，色谱柱：Agilent HP- 5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，载气：He气。初始温度：40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温至135 ℃，再以0.5 ℃/min升温至143 ℃，然后以1 ℃/min升温至150 ℃，最后以20 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min。

2.2.2 黄腺香青车前叶变种GC条件

进样口温度为250 ℃，进样量1 μL,分流比：30∶1，色谱柱：Agilent HP- 5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，载气：He气。初始温度：60 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升温至250 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min升温至300 ℃，保持10 min。

2.2.3 MS条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；接口温度260 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z：30～500；采集方式：全扫描模式。

2.3 保留指数(RI)的计算

将C7～C30正构烷烃对照品按照2.2项下分析条件测定其保留时间，根据线性程序升温的保留指数计算公式，求得保留指数(RI)值：

(1)

式中，tR保留时间，min；x待分析的化合物；Z，Z+1正构烷烃的碳原子数，且tR(Z)

2.4 抗肿瘤活性测试

采用MTT法测定香青和黄腺香青车前叶变种挥发油对四种肿瘤细胞系生长的抑制能力，并以顺铂(1.25 mg/mL PBS储备液)作为阳性对照。主要步骤如下：将肿瘤细胞培养至对数生长期，胰蛋白酶消化并离心收集细胞，细胞计数板计数后将细胞稀释至105cells /mL，接种至96孔板，每孔100 μL，过夜培养后，每孔加入经培养基稀释至2倍终浓度的待测样品，使药物的终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，每个浓度设置4个复孔，继续培养24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL PBS溶液)，继续培养4 h，培养结束后，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振荡至结晶完全溶解使用酶标仪在490 nm处检测吸光值。通过以下公式计算各组细胞的存活率：

细胞抑制率(%)=(对照组吸光度值-加药组吸光度值)/对照组吸光度值×100%

3 实验结果

3.1 挥发油成分分析

采用水蒸气蒸馏法提取制备大别山产香青和黄腺香青车前叶变种全株的挥发油，并用GC- MS进行检测，其总离子流见图1，其结果通过NIST2011质谱库进行检索，利用计算的保留指数与文献值比对进行定性，再用峰面积归一化法计算各化合物的相对含量，结果见表1。由表1可知，从香青和黄腺香青车前叶变种全株挥发油中共鉴定出73种化学成分，主要为萜类化合物。在香青挥发油中共鉴定出44种挥发性成分，占总挥发性成分的60.94%，其中倍半萜占46.33%、单萜占11.67%、二萜占0.14%。倍半萜类化合物中主要有α- 葎草烯(14.80%)、δ- 杜松烯(5.84%)、(E)- 石竹烯(5.24%)和γ- 雪松烯(2.57%)等；单萜类化合物中主要有α- 蒎烯(0.75%)；二萜类化合物有西柏烯(0.14%)。在黄腺香青车前叶变种挥发油中共鉴定出46种挥发性成分，占总挥发性成分的83.29%，其中倍半萜占67.74%、单萜占5.65%、二萜占4.05%。倍半萜类化合物中主要有(E)- 石竹烯(20.71%)、α- 葎草烯(8.56%)、顺式-β- 愈创木烯(7.27%)和γ- 姜黄烯(6.01%)等；单萜类化合物中主要有α- 蒎烯(2.14%)；二萜类化合物主要有香叶基-α- 松油烯(3.91%)。

图1 香青(A)和黄腺香青车前叶变种(B)挥发油总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oils of A.sinica(A) and A.aureopunctata var. plantaginifolia (B)

表1 大别山产香青和黄腺香青车前叶变种全株挥发油化学成分及相对含量

续表2(Continued Tab.2)

序号No.化合物名称Compound分子式Formula质量分数Content(%)保留指数Retention index香青A.sinica黄腺香青车前叶变种A.aureopunctata var.plantaginifolia计算值RIexp引用值RIlit文献Ref.10苯乙醛 BenzeneacetaldehydeC8H8O-0.221 0481 046611顺式-氧化呋喃芳樟醇 Linalool oxide,(furanoid),cis-C10H18O2-0.111 0721 075612芳樟醇 LinaloolC10H18O-0.481 1021 099613 1-Octen-3-yl acetateC10H18O2-0.531 1131 110614α-CampholenC10H16O0.13-1 1281 124615α-松油醇 α-TerpineolC10H18O-0.131 1921 190616桃金娘烯醇 MyrtenolC10H16O0.47-1 2001 194617顺式-香芹醇 Carveol,cis-C10H16O0.02-1 2341 227618丁子香酚 EugenolC10H12O2-0.461 3631 358619α-衣兰烯 α-YlangeneC15H240.20-1 3681 370620异喇叭烯 IsoledeneC15H24-0.331 3701 373721α-古巴烯 α-CopaeneC15H240.85-1 3721 376622α-柏木萜烯 α-FunebreneC15H24-0.811 3741 3678236S-2,3,8,8-Tetramethyltricyclo[5.2.2.0(1,6)]undec-2-eneC15H240.46-1 3751 3669241,2-二甲基-3,4-二乙基苯 Benzene,1,2-diethyl-3,4-dimethyl-C12H181.90-1 382 --25α-柏木烯 α-CedreneC15H242.111.641 4021 412626α-古芸烯 α-GurjuneneC15H240.332.051 4081 409627(E)-石竹烯 (E)-CaryophylleneC15H245.2420.711 4161 420628γ-马榄烯 γ-MaalieneC15H240.20-1 4231 4241029β-古芸烯 β-GurjuneneC15H242.310.531 4311 431630香树烯 AromadendreneC15H24-0.831 4381 441631α-雪松烯 α-HimachaleneC15H240.21-1 4431 445632α-葎草烯 α-HumuleneC15H2414.808.561 4511 453633别香树烯 AlloaromadendreneC15H240.710.371 4591 460634反式-α-香柠檬烯 α-Bergamotene,trans-C15H240.66-1 4571 435635γ-古芸烯 γ-GurjuneneC15H240.181.021 4711 472636γ-芹子烯 γ-SelineneC15H24-0.381 4741 4701137γ-依兰油烯 γ-MuuroleneC15H241.780.931 4771 476638γ-雪松烯 γ-HimachaleneC15H242.57-1 4781 476639γ-姜黄烯 γ-CurcumeneC15H24-6.011 4821 480640Ar-姜黄烯 Ar-CurcumeneC15H24-4.271 4861 482641雅槛蓝烯 Eremophilene C15H24-0.751 4901 48612

续表2(Continued Tab.2)

序号No.化合物名称Compound分子式Formula质量分数Content(%)保留指数Retention index香青A.sinica黄腺香青车前叶变种A.aureopunctata var.plantaginifolia计算值RIexp引用值RIlit文献Ref.42朱栾倍半萜 ValenceneC15H241.16-1 4921 492643α-姜烯 α-ZingibereneC15H240.95-1 4951 495644顺式-β-愈创木烯 β-Guaiene,cis-C15H24-7.271 4971 489645α-衣兰油烯 α-Muurolene C15H240.970.341 4991 498646β-红没药烯 β-BisaboleneC15H240.180.191 5081 508647α-紫穗槐烯 α-AmorpheneC15H241.67-1 5101 482648γ-杜松烯 γ-CadineneC15H24-0.901 5141 513649δ-杜松烯 δ-CadineneC15H245.841.581 5241 523650Cadina-1(2),4-diene,cisC15H240.14-1 5271 531651α-杜松烯 α-CadineneC15H24-0.241 5371 533652α-二去氢菖蒲烯 α-CalacoreneC15H200.55-1 5371 540653喇叭茶薁醇 PalustrolC15H26O0.39-1 5601 567654GleenolC15H26O0.23-1 5821 583655氧化石竹烯 Caryophyllene oxideC15H24O0.243.311 5831 581656绿花白千层醇 ViridiflorolC15H26O0.81-1 6001 591657环氧化葎草烯II Humulene epoxide IIC15H24O-1.441 6091 605658表-α-杜松醇 α-Cadinol,epi-C15H26O0.59-1 6341 63865910,10-Dimethyl-2,6-dimethylenebicyclo[7.2.0]undecan-5β-olC15H24O-0.561 6381 6211360β-桉叶油醇 β-EudesmolC15H26O-0.811 6511 6506614-(2,2-Dimethyl-6-methylenecyclohexyl)butanalC13H22O0.04-1 6851 7031462α-红没药醇 α-BisabololC15H26O-1.731 6861 683663十五醛 PentadecanalC15H30O-0.181 7151 714664十四酸 Tetradecanoic acidC14H28O-0.241 7791 767665六氢法呢基丙酮 Hexahydrofarnesyl acetoneC18H36O0.420.811 8461 844666香叶基-α-松油烯 geranyl-α-terpineneC20H32-3.911 9101 9021567西柏烯 CembreneC20H320.14-1 9161 9191668棕榈酸 Palmitic acidC16H32O2-3.571 9861 968669植醇 PhytolC20H40O0.210.142 1162 116670亚油酸 Linoleic acidC18H32O2-0.152 1472 129671二十三烷 TricosaneC23H480.05-2 298 --722,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚) Phenol,2,2′-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-]C23H32O20.03-2 4432 3981773二十五烷 OctadecaneC25H520.12-2 498--总计Total60.9483.29

3.2 抗肿瘤活性分析

抗肿瘤活性测试结果(表2)显示：大别山产香青和黄腺香青车前叶变种全株挥发油对肿瘤细胞A549、Hela、HepG2 、HTC- 116具有不同程度的抑制作用，具有剂量依赖关系，其中香青挥发油对结肠癌细胞HTC- 116的抑制作用最强，对宫颈癌细胞Hela有中等强度抑制作用；黄腺香青车前叶变种挥发油对结肠癌细胞HTC- 116和肝癌细胞HepG2的抑制作用均较强，对肺癌细胞A549具有中等强度抑制作用；对比两种挥发油的抗肿瘤活性可知，黄腺香青车前叶变种挥发油对肿瘤细胞系体外增值的抑制作用较香青挥发油强。

表2 抗肿瘤半抑制浓度值

注：顺铂为阳性对照。

Note:Cisplatin served as positive control.

4 讨论

本研究从两种香青属植物挥发油中共鉴定出73种化学成分，其中从香青挥发油中鉴定出44种挥发性成分，从黄腺香青车前叶变种挥发油中鉴定出46种。两种挥发油中相同成分有17种，包括(E)- 石竹烯、α- 葎草烯、α- 蒎烯、δ- 杜松烯和氧化石竹烯等，均为萜类物质，其相对含量分别占各自挥发油总量的46.24%和44.61%，主要相同成分在两种香青属植物挥发油中的含量差别较大，如α- 葎草烯、α- 蒎烯、δ- 杜松烯在香青挥发油中的含量高于黄腺香青车前叶变种，分别达到14.80%、10.56%、5.84%；而(E)- 石竹烯和氧化石竹烯在黄腺香青车前叶变种挥发油中的含量较高，含量分别为20.71%和3.31%。

α- 葎草烯对人前列腺癌PC- 3细胞系、人肺癌细胞系A- 549和人脂肪黑色素瘤M4BEU细胞系具有较强的抑制作用，IC50值分别为14.89、13.87和11.22 μg/mL[18]。δ- 杜松烯对人乳腺癌BT- 20细胞系和宫颈癌HeLa细胞系具有很强的抑制作用，IC50值分别为3.86和3.66 μg/mL[19]。(E)- 石竹烯对人乳腺癌BT- 20细胞系、宫颈癌HeLa细胞系和黑色素皮肤癌TB- 140细胞系具有很强的抑制作用，IC50值分别为3.92、3.86和4.86 μg/mL[20]。大别山产两种香青属植物挥发油对肿瘤细胞A549、Hela、HepG2 、HTC- 116的抑制作用可能与上述挥发油中含有的主要成分α- 葎草烯、(E)- 石竹烯和δ- 杜松烯等化合物的抗肿瘤活性有关。综上所述，本研究实验结果可以为进一步开发利用香青和黄腺香青车前叶变种的药用价值提供科学依据。