切片厚度和烘干温度对唐古特大黄蒽醌含量影响的研究

刘何春，姚小波，雷雪萍，周国英，聂秀青，熊 丰

1中国科学院西北高原生物研究所 藏药研究重点实验室，西宁 810008；2西藏自治区农牧科学院农业研究所，拉萨 850032；3青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，西宁 810008

蓼科(Polygonaceae)大黄属(RheumLinn.)植物唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.ex Balf.又名鸡爪大黄、Jun Muzha(藏药名)，是青藏高原独有的中药材和藏药材。生境在海拔高度2 300～4 200米的森林边缘、沟壑灌木及草地，分布于西藏东北部、青海东北部、甘肃南部、川西北部等[1- 3]。青藏高原的气候和地理特征，如海拔高、辐射强、积温少、昼夜温差大，造就了唐古特大黄独特的品质[2]。它的活性成分中主要包括大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄酸等在内的蒽醌类衍生物，这些成分的作用包括强致泻，对病源微生物有抗性、镇痛和抵抗炎症、保肝和利胆、调节免疫[4]。

中藏药种类繁多，加工方法因产地而异。不同的炮制、加工方法对中藏药材的成分及功效也有明显的影响，由此造成药材质量的不稳定性[5]。中藏药更注重来源和原产地加工方法，切片是加工根茎类药材最主要的方法：对于质地坚硬且不易干燥的粗大根茎药材，收获后应立即去除残留的茎和须，新鲜的根茎应用某些工具切制成固定的形状[6]。《中国药典》(2015年版)大黄项下的描述，没有对加工方法做明确要求；甘肃省地方标准 《无公害中草药- 大黄生产技术》中，对掌叶大黄各种加工规格做了相关规定，但也仅仅限于一些感官指标，对于其有效成分的含量要求并没有具体说明。目前对于蓼科大黄属植物药材大黄的产地加工报道仅限于甘肃省产区对于掌叶大黄的切制、干燥等加工方法的探讨[7- 11]，关于唐古特大黄切片加工的报道很少。 因此，加强药材切制方面的研究，加以在药材产地逐步推广，对于提高药材饮片的质量，具有十分重要的意义[12- 15]。

本文作者采用的是HPLC- DAD法，研究了唐古特大黄在不同烘干温度下，不同的切片厚度对于蒽醌含量的影响，目的在于完善唐古特大黄的加工工艺。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本实验所用的大黄药材样本采自青海省西宁市湟中县拦隆口镇，采挖时间为2012年10月，药材的生长年限为6年。根茎部洗净、去皮，趁鲜按照0.4、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 cm梯度厚度切片，分别置于25、50、75 ℃烘干，粉碎备用。

1.2 仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪Agilent1200型，包括脱气装置G1322A型、四元泵G1311A型、标准型自动进样器G1329A型、柱温箱G1316A型、二极管阵列检测器G1315D型。旋转蒸发仪N- 1001D- WD型。

试剂：实验室自制HPLC级超纯水；氯仿、盐酸、冰乙酸、分析级甲醇等有机溶剂；色谱级别甲醇；对照品包括：批号110795- 201007芦荟大黄素、批号110757- 200206大黄酸、批号110756- 200110大黄素、批号110758- 201013大黄素甲醚和批号：110796- 201118大黄酚，购买于中国食品药品检定研究院。

1.3 色谱分析方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱采用的是Agilent Eclipse plus C18柱(4.6×250 mm，5 μm)(反向C18是色谱柱填料)。体积流量1.000 mL/min。色谱甲醇作为流动相A，0.1%冰乙酸溶液作为流动相B；0～20 min，60%～80% A；20～40 min，80%～95% A；40～45 min，95% A作为梯度洗脱程序。25 ℃作为色谱柱柱温，254 nm作为本次试验检测波长。

1.3.2 制备本试验的对照品溶液和供试品溶液

精密称取对照品大黄酚0.55 mg、大黄素甲醚1.24 mg、大黄素1.12 mg、大黄酸0.60 mg、芦荟大黄素1.10 mg，使用甲醇将其分别溶解，并定容至25 mL的容量瓶中，制成含22 μg/mL大黄酚、49.6 μg/mL大黄素甲醚、44.8 μg/mL大黄素、24 μg/mL大黄酸、44 μg/mL芦荟大黄素的对照品溶液。

称重约0.150 g本品粉末(通过四号筛)，准确称重，将其置于带塞的锥形瓶中，并准确加入25 mL的甲醇，称定其重量，加热回流1 h，放至其冷却，再次称重量，并用甲醇溶液补足在回流过程中由于蒸发损失的量，摇匀并过滤。量取5 mL续滤液，放置于烧瓶中，旋转蒸发仪中挥去溶剂，加入10 mL 8%盐酸溶液，在220 W、40 kHz、30 ℃下超声处理2 min，再加10 mL氯仿，加热回流1 h，放置至冷却，分离氯仿层，用氯仿萃取酸性溶液三次，每次10 mL，合并氯仿溶液，并在减压条件下将回收溶液恢复至干燥，甲醇溶解残渣，转移到10 mL量瓶中，将续滤液取出，通过0.45 μm滤孔的微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

1.3.3 方法学考察[14,15]

方法学考察内容包括：回归方程绘制、稳定性试验、精密度试验、重复性试验、加样回收率试验。结果分别表明：对照品在24小时内和5天内稳定性良好，仪器和进样精密度良好，重复性良好，回收率良好。

表1 蒽醌方法学指标

1.3.4 样品测定

精密称量样品粉末约0.150 g，制备供试液，注入液相色谱仪Agilent1200型，并将每批次平行测量三次，记录色谱图的峰面积，并使用标准曲线测算含量。样品色谱图和混合对照品如图1所示。

图1 混合对照品(左)和样品(右)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram mixed standard(Left)and sample(Right) 注：1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄素甲醚；5.大黄酚。Note：1.Aloe emodin；2.Rhein acid；3.Emodin；4.Physcion；5 Chrysophanol.

2 结果与分析

2.1 五种蒽醌成分含量测定结果

2.1.1 芦荟大黄素成分含量测定结果

在不同烘干温度下的不同切片厚度唐古特大黄芦荟大黄素含量如表2所示。在相同温度下，唐古特大黄芦荟大黄素含量的变化随切片厚度增加呈双峰变化。在25 ℃，厚度3 cm，50、75 ℃，厚度2 cm出现第1个峰值。此后芦荟大黄素含量随着厚度的增加而下降。温度为25、50 ℃，厚度5cm，75 ℃，厚度4 cm时芦荟大黄素含量达最低值。在25、50 ℃，厚度8 cm，75 ℃，厚度5～7 cm时出现第2个峰值。

芦荟大黄素有抗菌、泻下的功效，以其为主要成分入药的话，建议低温烘干时切片6～9 cm或0.4～3 cm；中温烘干时切片6～8 cm或0.4～3 cm；高温烘干时切片5～7 cm或0.4～3 cm。

数据分析由SPSS 20.0统计软件包中的one- way ANONA模块进行，95%置信区间。

2.1.2 大黄酸成分含量测定结果

不同切片厚度唐古特大黄药材在不同烘干温度下大黄酸含量如表3所示。在相同温度下，唐古特大黄大黄酸含量的变化随切片厚度增加呈w型变化。三种温度下的大黄酸含量的第一个峰值出现在0.4 cm时。低、中、高温下分别在4、3、2 cm时出现第二个峰值。中低温下在8 cm，高温下在7 cm含量达到第三个峰值。

表2 不同切片厚度和不同温度下唐古特大黄中芦荟大黄素含量(n=5)

注：含量=均值±标准差；表中的不同字母表示差异显著，相同的字母表示差异不显著。下表同。

Note:Content = mean ± standard deviation;The different letters in the table indicate significant differences,and the same letters indicate that the differences are not significant.The table below is the same.

大黄酸有抗菌、抗癌、导泻、利尿的功效，以其为主要成分入药的话，建议中、低温下切片厚度6～8 cm；高温下切片厚度0.4～2 cm或7 cm。

表3 唐古特大黄药材不同切片厚度大黄酸含量的测定结果(n=5)

注：含量=均值±标准差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.1.3 大黄素成分含量测定结果

不同切片厚度唐古特大黄药材中大黄素含量如表4所示。在相同温度下，唐古特大黄大黄素含量的变化随切片厚度增加同样呈双峰变化。25 ℃、3 cm时，50 ℃和75 ℃、2 cm时出现第一个峰值。此后大黄素含量随着厚度的增加而下降，25 ℃、50 ℃、5 cm时，75 ℃、4 cm时大黄素含量达最低值。25 ℃、75 ℃、7 cm时，50 ℃、8 cm出现第二个峰值。

大黄素的功效诸如抗菌、镇咳、抗肿瘤、抗痉挛、抗高血压、利尿等，以其为主要成分入药的话，建议采用高温烘干且切片厚度2 cm或6～7 cm；或在中温下烘干，切片8 cm；或在低温下烘干，切片0.4～3 cm。

表4 唐古特大黄药材不同切片厚度大黄素含量的测定结果(n=5)

注：含量=均值±标准差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.1.4 大黄素甲醚成分含量测定结果

唐古特大黄药材在不同切片厚度的情况下，大黄素甲醚含量如表5所示。在相同温度下，唐古特大黄大黄素甲醚含量的变化随切片厚度增加呈双峰变化。25 ℃和50 ℃的第一个峰值出现在3 cm时，75 ℃出现在2 cm时。之后，大黄素甲醚的含量随厚度的增加而降低，温度为25 ℃，厚度5 cm；50、75 ℃，厚度4 cm时含量达最低值。25 ℃和75 ℃的第二个峰值出现在7 cm时，50 ℃出现在8 cm时。

大黄素甲醚体外抗菌作用显著，若取其为主要成分入药的话，建议高温下烘干厚度控制在2 cm或6～7 cm；中温下烘干含量较低，但是建议切片8 cm；低温下烘干建议切制0.4～3 cm。

表5 唐古特大黄药材不同切片厚度大黄素甲醚含量的测定结果(n=5)

注：含量=均值±标准差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.1.5 大黄酚成分含量测定结果

不同切片厚度唐古特大黄大黄酚含量如表6所示。在相同温度下，唐古特大黄大黄酚含量的变化随切片厚度的增加也呈现出双峰变化。25 ℃、50 ℃在3 cm时出现第一个高峰，75 ℃是在2 cm时。此后大黄酚含量随着厚度的增加而下降，25 ℃、5 cm，50 ℃、6 cm，75 ℃、4 cm时含量达最低值。25 ℃、75 ℃下在7 cm时出现第二个高峰，50 ℃在8 cm时。

大黄酚的功效诸如镇咳、抗菌、利尿、促肠管蠕动、神经刺激和肌肉麻痹等，若取其为主要成分入药的话，建议高温下烘干切片2 cm或6～7 cm；中温下烘干切片0.4～3 cm或8 cm；低温下烘干含量较低，不宜采用。

表6 唐古特大黄药材不同切片厚度大黄酚含量的测定结果(n=5)

注：含量=均值±标准差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.2 总蒽醌含量测定结果

在不同烘干温度下，不同切片厚度唐古特大黄药材总蒽醌含量如表7所示。在相同温度下，唐古特大黄总蒽醌含量随切片厚度增加呈双峰变化，同单项蒽醌含量变化表现出基本一致的变化规律。25和50 ℃时总蒽醌含量第一个峰值出现在厚度3 cm，75 ℃时第一个峰值出现在厚度2 cm。此后，总蒽醌含量随着厚度的增加而下降，温度25 ℃和50 ℃，厚度5 cm；75 ℃，厚度4 cm时总蒽醌含量降至最低。然后，随着厚度的增加，三个温度下的含量都随之升高，25 ℃和75 ℃，厚度7 cm；50 ℃，厚度8 cm时出现第二个峰值。

唐古特大黄在不同温度25、50、75 ℃烘干条件下，总蒽醌含量随切片厚度的变化规律是一致的。

5种蒽醌的含量：大黄酸>大黄素甲醚>大黄酚>芦荟大黄素>大黄素。

比较25、50、75 ℃烘干时不同切片厚度总蒽醌的含量，75 ℃烘干时，切片2 cm和7 cm时总蒽醌含量最高，但耗能较大。25 ℃时总蒽醌含量较75 ℃稍低，25 ℃烘干耗能最低。综上所述，唐古特大黄产地加工，烘干温度25 ℃和50 ℃时0.4～3 cm以及6～8 cm，或75 ℃时切片厚度0.4～2 cm以及6～7 cm，蒽醌含量最高。

表7 唐古特大黄药材在不同切片厚度和不同烘干温度时总蒽醌含量(n=5)

注：含量=均值±标准差。

Note： Content = mean ± standard deviation.

图2 不同厚度、不同烘干温度唐古特大黄药材的总蒽醌含量示意图Fig.2 The content of anthraquinone derivatives under different thickness of R.tanguticum

3 讨论

《中国药典》(2015年版)规定：按干燥品计算，大黄药材中含大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、大黄酸以及芦荟大黄素的总量不得少于1.5%。由表7可见，本实验所采药材唐古特大黄所含蒽醌总量均高于药典规定，且部分切片厚度的总蒽醌含量高达药典规定的2～3倍，这也充分证明了青海省唐古特大黄药材的优质和道地性。

新鲜中、藏药材在原产地就趁鲜切制成片，不仅缩短了加工环节，节约了能源，而且保持了良好的色泽和气味[6]。《中国药典》关于大黄“刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥”的加工规定，表述模糊或不确定性高[1,14,15]。近年来甘肃大黄药材产区，在继承传统加工方法的基础上，重视大黄产地加工方法的研究，把甘肃种植掌叶大黄做为研究对象，采用现代设备在切制、干燥等加工方法进行探讨[7- 11,14,15]。切制方面，对于大黄切片厚度的研究，Song[7]、Li[8]曾以2～4 mm的厚度进行研究；Dai[ 9]、Tang[10]曾以2～3 cm的厚度对其研究；其他或切长条5 cm[9]或采用传统加工方法——药材不切片仅将体积特别大的主根截成长约10～13 cm段或者纵剖为两半[1]、或分薄中厚切片研究[11]。得出的结论也不尽相同，如Xu[11]在不同切制条件对掌叶大黄的影响中得出的结论是薄片和中片较好，但是薄片和中片范围模糊，产地加工时难以界定和操作。参照上述研究，除Tang[10]和Xu[11]对掌叶大黄的加工有稍微明确的加工条件外，其他的研究结果并不明确。由于掌叶大黄和唐古特大黄的产地和品质的不同，掌叶大黄的加工方法并不一定适用唐古特大黄。

4 结论

本实验对唐古特大黄加工时建议，烘干温度25和50 ℃时0.4～3 cm以及6～8 cm，或75 ℃切片厚度0.4～2 cm以及6～7 cm，蒽醌含量最高。在实际的加工生产过程中，根茎类药材饮片加工既包括切片也包括切段：如果切片，即0.4～3 cm是推荐厚度；如果切段，则6～8 cm是推荐厚度。药材的产地加工需要根据实际情况进行标准化，以确保产品质量符合标准要求。不同切片厚度结合高中低三种烘干温度，总蒽醌和五种蒽醌的含量及变化趋势呈现出了一定的相似性，总蒽醌和五种蒽醌相互证实，证明了规律的可信度。