麦积山野生刺五加多酚与黄酮的超声辅助提取与体外抗氧化活性的研究

王彦博，石 燕，袁毅君

天水师范学院化学工程与技术学院，天水 741000

刺五加Acanthopanaxsenticocus(Rupr.rt Maxim.) Harms为五加科植物，野生资源丰富，全株均可入药。因刺五加富含多种活性成分[1]，主要含有刺五加苷类、多糖、黄酮、木脂素、酚酸等[1,2]，Chen等[3]利用电喷雾质谱发现刺五加叶中存在槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素和芦丁4种黄酮类化合物；Chen等[2]通过UPLC- Q- TOF- MS/MS法从刺五加叶中鉴定出30个化合物，其中黄酮类化合物9个，有机酸类化合物8个，三萜及皂苷类化合物2个，木脂素类化合物2个，香豆素类化合物3个，氨基酸类化合物3个和其他类化合3个，因此其被广泛应用于临床。大量药理研究表明：刺五加具有保护心脑血管[4]、抗肿瘤[5]、治疗糖尿病[6]、抗疲劳[7]、调节神经系统[8]等作用。

天水市麦积山山区，野生刺五加资源丰富，每年4～6月，漫山遍野的野生刺五加就是人们的美味佳肴，当地人俗称它为“五撮典”，经天水师范学院生物科学与技术学院老师鉴定为野生刺五加。由于刺五加的嫩茎叶可以制做多种美味佳肴，故秦岭山脉一带居民将其作为一种功能性“药食同源”食品，很受欢迎。因此提取其中的天然活性物质并对它的抗氧化活性进行研究很有必要。

多酚与黄酮是植物特有的活性物质，已有研究表明多酚与黄酮类物质具有清除活性过氧自由基、延缓衰老、预防心血管疾病、抗癌、抗炎等生理功能[9,10]，所以含有多酚与黄酮的植物作为一种天然抗氧化剂，在食品、医药等领域被广泛关注和研究。

麦积山野生刺五加茎叶中多酚与黄酮的提取和抗氧化活性研究目前尚未见到文献报道。为充分利用资源，进一步提高其经济价值，本次实验原料来源于麦积山野生刺五加，选取茎叶为研究对象，利用超声辅助提取酚类与黄酮类物质，获取最佳提取工艺条件，在此基础上，测定其含量，并对最佳条件下的提取物做体外抗氧化活性研究。通过研究为麦积山野生刺五加的综合利用，生产天然抗氧化剂以及功能性食品的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生刺五加(Acanthopanax),5月份采自天水市麦积山自然保护区。浓盐酸、硫酸、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、碳酸钠、磷酸钠、钼酸铵、氢氧化钠、过氧化氢、无水乙醇、石油醚、邻苯三酚、水杨酸、抗坏血酸(Vc)、Tris- HCl萃取液,以上均为国药集团化学试剂有限公司产品AR；1,1- 二苯基- 2- 三硝基苯肼(DPPH)标准品，美国Sigma- Aldrich公司；没食子酸标准品，中国药品生物制品检定所；芦丁标准品，北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

KQ- 500VDB型、KQ- 700VDE型三频数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；PTY- 224/323型电子天平，美国康州HZ电子科技有限公司；UV- 2550型，紫外- 可见分光光度计，日本岛津公司；DHG- 9076A型电热鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司；KL04A型离心机，上海安亭科学仪器厂；HH- S4型数显恒温水浴，江苏省金坛市医疗仪器厂；RE- 201型旋转蒸发仪，上海铌欧仪器有限公司；FD- A10N- 50 冷冻干燥机，上海胜卫电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

野生刺五加于2018年5月采自天水市麦积山区，只取茎和叶，40 °C烘干、粉碎、过60目筛，于60 °C恒温干燥箱中干燥直到恒重，冷藏(4 °C)避光保存备用。

1.3.2 提取工艺

1.3.2.1 取上述备用原料，用石油醚脱脂后，以70%乙醇为溶剂，按实验所设计工艺条件进行超声提取，过滤，滤液用5 000 rpm离心15 min，将上层清液，测定总多酚和总黄酮的含量。

1.3.2.2 按本实验所得到的最优条件进行提取，获得上层清液后旋转蒸发，浓缩后真空冻干36 h，转入棕色瓶低温(- 20 °C)避光保存，用于抗氧化实验。

1.3.3 多酚和黄酮的提取工艺优化

1.3.3.1 单因素试验

以总多酚与总黄酮提取量为考察指标，工艺参数选取如表1所示,每个因素水平均进行3次提取，平均值即为总多酚和总黄酮提取量。

表1 单因素试验

1.3.3.2 正交试验

在单因素实验基础上，采用正交试验进行优化。设计L9(34)正交实验用以确定提取野生刺五加总多酚和总黄酮的最佳工艺条件，正交实验因素水平见表2所示。

表2 正交试验因素与水平

1.3.4 总多酚含量的测定

采用福林- 酚比色法[11]测定。用70%乙醇配制没食子酸标准液质量浓度为0.250 0 mg/mL溶液。由表3可知，定容后60 °C水浴加热0.5 h，冷却后暗处放置。取上层清液于760 nm处测定Y吸光度，得到标准曲线方程为Y=3.990 1X+0.051 3，R2=0.998 2，结果以没食子酸当量(mg GAE/g，以干质量计，下同)表示。线性范围为 5.86～36.32 mg GAE/g。

表3 绘制福林- 酚比色法标准曲线的相关数据

取1 mL刺五加样品液,按没食子酸标准曲线制作的方法测定总多酚Y吸光度,得总多酚浓度X1，按下式(1)计算：

(1)

式中：X1—总多酚浓度 (mg/mL)，V—提取液体积(mL)，N—稀释倍数，M—样品质量(g)

1.3.5 总黄酮含量的测定

采用NaNO2- Al(NO3)3- NaOH比色法[12]基础上改进。配制过程按表4依次加入，每步均需静置15 min,然后在510 nm波长处测Y吸光度, 得到标准曲线方程为Y=0.477 1X+0.042 6，R2=0.998 8。结果以芦丁当量(mg RE/g)表示,线性范围为4.73～49.82 mg RE/g 。

表4 绘制NaNO2- Al(NO3)3- NaOH比色法标准曲线的相关数据

取1 mL刺五加样品液,按芦丁标准曲线制作的方法测定总黄酮Y吸光度,得总黄酮浓度X2，按下式(2)计算：

(2)

式中：X2- 刺五加总黄酮质量浓度(mg/mL)；N- 稀释倍数；V- 提取液体积(mL)；M- 样品质量(g)

1.3.6 野生刺五加体外抗氧化活性测定

1.3.6.1 总抗氧化能力的测定

参照文献配制磷钼试剂[13]。所有实验用蒸馏水作空白参比溶液，相同质量浓度梯度的人工合成的Vc作为对照。用相同的方法按表5测定A吸光度。对照品Vc不需加热。

表5 总抗氧化能力试验

1.3.6.2 1，1- 二苯基- 2- 三硝基苯肼(DPPH)法自由基清除能力的测定

参考文献[14]配制DPPH溶液(0.2 mmol/L，无水乙醇溶液溶解，现用现配)，避光于室温条件下贮存。所有实验以蒸馏水作空白参比液。相同质量浓度梯度的人工合成的VC作为对照，用相同的方法测定(如表6所示)，并按公式(3)计算其DPPH自由基清除率。

(3)

表6 DPPH自由基清除能力的试验

(4)

表7 超氧阴离子自由基清除能力的试验

1.3.6.4 羟自由基(·OH)清除率测定

参考文献[16]的方法改进,，实验过程如表8所示。所有实验用蒸馏水作空白参比溶液，相同质量浓度梯度的人工合成的Vc作为对照。用相同的方法测定，按公式(5)计算羟自由基(·OH)清除率。

(5)

表8 羟基自由基清除能力的试验

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 超声时间对总多酚与总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of total polyphenols and total flavonoids

由图1可知，总多酚与总黄酮提取量在超声提取时间为10～40 min之间时，显著上升，40 min以后总多酚与总黄酮提取量趋于平稳。这可能是由于超声提取初期，细胞破碎程度迅速增加，使得提取液中总多酚与总黄酮含量不断增加。当超声时间超过40 min后，刺五加总多酚与总黄酮已基本溶出，因此提取量并未发生显著变化[17]。故选择超声时间为40 min，此条件下总多酚提取量为22.50±0.15 mg GAE/g，总黄酮提取量为25.61±0.16 mg RE/g。

由图2可得，超声功率从200～500 W时，总多酚提取量逐步增加，当超声功率超过500 W时，总多酚提取量逐渐下降，这可能与超声波引起的“机械效应和空化效应”有关。导致酚类和黄酮类物质渗透速率加快[17]。当超声功率超过500 W后，过高的“空化效应”会破坏刺五加多酚和黄酮的结构，同时杂质溶出增加，导致总多酚和总黄酮提取量的有所下降。所以适宜超声功率选择500 W，此条件下总多酚提取量为 23.51±0.15 mg GAE/，总黄酮提取量为26.12±0.18 mg RE/g。

图2 超声功率对总多酚与总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of total polyphenols and total flavonoids

由图3可知，当提取温度在 20 ～50 °C时，刺五加总多酚与总黄酮提取量显著上升，但随着温度的进一步升高，提取量逐步降低。这是由于温度在一定范围内升高时，有利于多酚与黄酮类物质的溶解，降低分子之间的粘滞度，增加多酚与黄酮类物质的溶出量。但温度过高，多酚与黄酮类物质结构的完整性会遭到破坏[18]。反而使提取量有所下降，故选择适宜温度为50 °C，此条件下总多酚提取量为24.31 ± 0.21 mg GAE/g，总黄酮提取量为27.60 ± 0.23 mg RE/g 。

图3 提取温度对总多酚与总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction amount of total polyphenols and flavonoids

图4 料液比对总多酚与总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction efficiency of total polyphenols and total flavonoids

由图4可知，料液比在1∶20～1∶35(mL∶g)时，多酚与黄酮类物质提取量随着溶剂量的增加而增大，当液料比达到1∶35(mL∶g)时，提取量达到最大(总多酚24.51±0.17 mg GAE/g；总黄酮27.42 ±0.21 mg RE/g)；此后若继续增加溶剂的用量，总多酚与总黄酮提取量反而呈缓慢下降趋势，最后趋于稳定。这可能是由于溶剂在一定条件下有一定的溶解度，故随着溶剂量的增加提取量增加，液料比为1∶35(mL∶g)时已达到溶出极限，继续增加溶剂的量则会溶解大量的色素、非多酚和非黄酮等醇溶性杂质，这可能降低了溶剂的溶出能力，而溶解的杂质也可能与溶解的多酚和黄酮在溶液中重新结合，从而降低了提取量。所以考虑提取成本和后续的回收操作，故选取液料比1∶35(mL∶g)，此条件下总多酚的提取量为24.51 ± 0.17 mg GAE/g ；总黄酮的提取量27.42 ± 0.21 mg RE/g 。

2.2 正交试验设计及结果

通过单因素试验，可知刺五加总多酚与总黄酮提取量受以上4个因素的影响较大，故设计L9(34)正交试验，来考察总多酚与总黄酮提取量，得到优组合条件，并对其进行三次平行验证实验。由表9可知A2B3C3D2为提取最佳工艺条件，即超声时间40 min、超声功率600 W、提取温度60 °C、料液比1∶35(g∶mL)。

表9 正交试验设计及结果

续表9(Continued Tab.9)

试验骗号No.A 超声时间Ultrasonic time(min)B 超声功率Ultrasonic power(W)C 提取温度Ultrasonic temperature(°C)D 料液比solid-liquid ratio(g∶mL)总多酚提取量Total polyphenol leach(mg GAE/g)总黄酮提取量Total flavonoids extraction amount(mg RE/g)优水平Optimal levelA2B3C3D2优组合Optimal combinationA2 B3 C3 D2

由表10可知，总多酚与总黄酮提取效果受超声温度影响显著,影响因素主次顺序为：C>D>B>A。

表10 正交试验方差分析

注：F0.10(2.2)=9.0；F0.05(2.2)=19.0；F0.01(2.2)=99.0。

2.3 提取最佳工艺验证试验

由表11可知，按照最佳工艺条件A2B3C3D2进行3次平行验证实验表明，此条件下总多酚与总黄酮提取量均高于以上9个试验组合，平均提取量为总多酚25.21 ± 0.17 mg GAE/g，总黄酮28.11 ± 0.19 mg RE/g。结果证明，在此工艺条件下提取，稳定可行。

2.4 总抗氧化能力

由图5可知，麦积山野生刺五加提取物的总抗氧化能力随其质量浓度增加逐步上升，表现出明显的量效关系。当提取物质量浓度在25.00～150.00 mg/L之间时，吸光度逐渐增大，抗氧化能力逐渐增强；当提取物质量浓度大于150 mg/L时，总抗氧化能力增加逐渐趋于平缓；当提取物质量浓度达到300 mg/L时，总抗氧化能力达到最大。整体来看，野生刺五加提取物的总抗氧化能力略强于人工合成的VC(P<0.05)。

2.5 DPPH自由基清除能力

由图6可知，麦积山野生刺五加提取物和人工合成VC都有清除DPPH自由基的作用。对于刺五加来说，当提取物质量浓度在60.00～140.00 mg/L之间时，清除DPPH自由基的能力增强很快，清除率从65.12%±1.27% 增加到90.29%±1.29%；当提取物质量浓度在140.00 mg/L 后清除率增加变平缓，当提取物质量浓度在440.00 mg/L时，清除率最大，达到94.52%±1.30%。整体来看，野生刺五加提取物对DPPH自由基清除能力显著强于人工合成的VC(P<0.05)。

表11 验证性试验

图5 刺五加提取物总抗氧化能力 Fig.5 Total antioxidant capacity of extractive from Acanthopanax

图6 刺五加提取物对DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of extractive from Acanthopanax

2.6 超氧阴离子自由基清除能力

图7 刺五加提取物溶液对清除效果Fig.7 Superoxide anion free radical scavenging effect of extract from Acanthopanax

图8 刺五加提取物溶液对·OH清除效果Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging effect of extract from Acanthopanax

2.7 羟自由基(·OH)清除能力

由图8可知，麦积山野生刺五加提取物和人工合成VC都有清除羟基自由基(·OH)的作用。当刺五加提取物质量浓度小于14.00 mg/L时，清除能力弱于人工合成VC；当质量浓度等于14.00 mg/L时，刺五加 提取物和人工合成VC清除能力相同,此时清除率达到20.0%；当提取物质量浓度大于14.00 mg/L时，刺五加提取物清除能力显著强于人工合成VC(P<0.05)；当刺五加提取物质量浓度在 10.00～60.00 mg/L之间时,清除羟自由基(·OH)能力增强很快，清除率从12.12%±2.09%增加到85.52%±2.11% ；当提取物质量浓度在60.00 mg/L后清除率增加变平缓；当提取物质量浓度在100.00 mg/L时，清除率最大，达到94.23%±1.53%。整体来看，野生刺五加提取物对羟自由基(·OH)清除能力显著强于人工合成的VC(P<0.05)。

3 结论

本实验是以麦积山自然保护区野生刺五加为原料，研究对象为刺五加中有效成分总多酚和总黄酮，采用方法是用70%乙醇超声辅助提取。单因素实验做基础，通过正交试验对所选的四个参数进行四因素三水平的工艺优化，得出最优组合为A2B3C3D2，即超声时间40 min、超声功率600 W、提取温度60 °C、料液比 1∶35(g∶mL)，并对此条件进行三次平行验证实验，平均提取量为总多酚25.21 ± 0.17 mg GAE/g ；总黄酮28.11 ± 0.19 mg RE/g 。此方法原料为野生刺五加茎叶粉末，成本较低，提取效果良好，适合工业生产。

植物中多酚和黄酮类物质含量的高低除与它种类、结构有关外，还与采摘、保存、提取方法等因素有关，本实验只对麦积山野生刺五加的提取，抗氧化活性进行了初步研究，后续还需做很多研究工作，如活性成分的分离、各有效成分间的协同作用、活性关系等。