调节性T细胞在重症肌无力中的研究进展

徐凯翎综述, 张艺凡审校

重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是指主要由补体参与、T细胞依赖、抗体介导的获得性自身免疫性疾病，主要临床表现为眼肌、延髓肌或四肢肌波动性的无力或易疲劳性，除了眼肌外，通常受累肌肉是对称的，全球年发病率约为(8～10)/100万人，各个年龄段在不同的诱因下均可发病[1]。以往大量研究认为B细胞产生的针对神经肌肉接头处突触后膜上的相关受体的抗体会通过干扰正常的神经肌肉传递而导致MG的发病。然而自身抗体的产生虽是由B细胞介导的，但是抗体的产生和MG的发生发展均离不开调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)的参与。本文就Treg细胞的特性及在重症肌无力发病过程中的数量及功能变化进行叙述。

1 Treg

Treg这一概念最初由Gershon等人在20世纪70年代首先提出，近年来大量研究发现Treg具有控制病原体介导的免疫反应并在维持免疫自耐受性和免疫稳态方面发挥至关重要的作用。通常人体内的CD4+T细胞会分化以下几种亚群：Th1、Th2、Th17、滤泡辅助T细胞和Treg,Th1、Th2和Th17在体内又称为效应T细胞，可通过体液免疫和/或细胞免疫的方式促进炎症反应的发生发展，而Treg的功能受损或体内平衡失调可能与炎性反应和自身免疫性疾病的发展有关，例如多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Ⅰ型糖尿病等[2]。

1.1 Treg的分化与发育 根据Treg的发育部位，Treg大致可分为由胸腺天然生成的调节性T细胞(nTreg)和外周经诱导生成的适应性调节性T细胞(aTreg或iTreg)。来自骨髓中的淋巴干细胞在胸腺经历阳性选择及阴性选择后发育成为CD4或CD8的单阳性T细胞，其中的部分CD4单阳性T细胞在接受中等强度T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)信号刺激分化为功能性的nTreg。nTreg在胸腺中的发育还需树突状细胞及髓质和皮质胸腺上皮细胞提供的nTreg发育所必需的共刺激信号，如CD28或CD40等。外周中的CD4+T细胞在非自身抗原包括过敏原，微生物和食物等刺激及在转化生长因子-β(transforing growth factor-β，TGF-β)和IL-2(Interleukin-2)参与下在胸腺外的特定位置发育成为iTreg，尤其是在胃肠道和呼吸道的粘膜表面，研究发现Treg约占脾脏和外周血CD4+T细胞总数的5%～10%[3]。

1.2 Treg的细胞分子标志 Treg细胞表面高度表达CD4+，CD25+(也称为IL-2Rα，即白细胞介素2受体α链)。转录因子P3(Forkhead box P3,Foxp3)的表达是Treg细胞的标志性转录因子，Foxp3持续且稳定的表达对于维持Treg细胞的正常分化和功能发挥关键作用。人类的FOXP3基因定位在X染色体的p臂上，FOXP3启动子与T细胞功能的关键转录因子包括NFAT、AP-1和NF-κB等转录因子结合并被激活后开始转录。Foxp3可抑制IL-2转录，上调CD25和其他Treg标记的表达，并具有抑制其它CD4+T细胞的活性。Foxp3基因突变会破坏Treg的功能并导致小鼠和人类的自身免疫性疾病。健康小鼠突变为Scurfy小鼠的原因为Foxp3基因中插入了2个碱基对并表达出较短的非功能性的蛋白质，从而导致这些小鼠的Treg无法有效抑制效应T细胞及其分泌的相关促炎性细胞因子，因此表现出鳞屑、皮肤褶皱、眼睛发红、脾脏和淋巴结肿大以及早亡的特征。人类FOXP3的基因突变可导致典型的致命性免疫失调、多内分泌病、肠病和X连锁综合征(immunodysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy and X-linked，IPEX)[4,5]；另一方面，体外分离Foxp3介导的T细胞转移可抑制炎症T细胞的活性及功能。这些均表明调节Foxp3的表达对控制免疫反应至关重要[6]。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，GITR在nTreg上高度表达,而在幼稚T细胞表面也可低水平表达，但在激活后其表达可上调[7]。GITR是Treg分化和扩增的关键参与者，GITR激活后与其配体(GITRL)相互作用而发挥共激活信号的作用。在小鼠中的研究中支持GITR激活在Treg扩增中的作用，在GITR基因敲除的小鼠中Treg细胞的数量较正常小鼠低，通过PCR从克隆的小鼠扩增了Fc-GITR-L融合蛋白将其应用于小鼠，有利于小鼠Treg细胞的增殖[8]。Foxp3+Treg表达细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)可负反馈调节Treg体内平衡稳态，用抗CTLA-4抗体可通过阻断CTLA-4信号传导可大大提高Treg增殖频率和体内Treg的数量[9]。但是，有研究表明表达CTLA-4的Treg细胞的百分比可能存在个体和组织的差异。例如，一些研究报告表明健康成人和新生儿中约50%～90%的Foxp3+Treg表达CTLA-4;然而，在其他研究报道中，大约23%的外周血Foxp3+Treg表达CTLA-4。此外，在直肠粘膜组织活检中，大约50%的Foxp3+Treg表达CTLA-4[10]。Treg细胞还表达低水平的CD127(IL-7受体α链)，但CD127与Foxp3的表达成反比。由于活化效应T细胞也表达CD127，使得该标记的利用受到限制[11]。另有研究发现在健康个体中大约4%～17%的外周血和直肠粘膜的Treg表达程序性死亡-1(Programmed death-1，PD-1)[12]。此外有助于描述Treg细胞亚群的分子还包括CD39、CD95、OX40,但上述分子在Treg上的作用有待进一步研究。

1.3 Treg亚群 最近的几项研究表明，人类Treg细胞具有功能和表型多样性,基于Foxp3和白细胞抗原亚型RA(CD45RA)表达不同，Treg细胞可分为以下3种亚群:CD25+CD45RA+Foxp3lo静止Treg细胞(rTregs)，CD25hiCD45RA-Foxp3hi活化的Treg细胞(aTregs)和分泌细胞因子的非抑制性非Treg细胞CD25+CD45RA-Foxp3lo，前两者在体外均具有抑制作用。需要注意的是，静止的和活化的Treg代表相同细胞的两个发育阶段，rTregs在相关刺激下可活化为aTregs[13]。

1.4 Treg介导的免疫抑制机制

1.4.1 分泌抑制性细胞因子 Treg可通过分泌具有免疫抑制作用的细胞因子如IL-10、IL-35和TGF-β发挥其调节作用。IL-10是Treg细胞分泌的大小为18 kDa的蛋白，广泛作用于效应T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞等，具有抗炎和免疫调节的作用[14]。在大鼠中已观察到IL-10通过结合树突状细胞中IL-10受体从而激活JAK1-TYK2-STAT3途径以降低MHC-Ⅱ类分子，CD80或CD86，CD11b/c等分子的表达达到抑制树突状细胞成熟的功能。此外，IL-10可抑制Th1细胞炎性细胞因子(如IL-12、INF-γ、IL-1β、IL-6，TNF-α)的分泌，它也促进巨噬细胞的吞噬活性增加了炎症部位细胞碎片的清除[15]。IL-35是IL-12家族中的异二聚体细胞因子，由p35和EBI3亚基组成。IL-35具有两个已知功能：(1)抑制辅助T细胞的增殖;(2)促进幼稚T细胞分化为Treg细胞。最近，这种细胞因子被证明具有诱导B淋巴细胞向B调节细胞转化的能力[16]。TGF-β是一个25 kDa的蛋白质和一种多功能细胞因子，目前已经提出了4种主要作用机制：(1)抑制效应T细胞的分化；(2)促进幼稚T细胞分化为Treg或Th17细胞；(3)抑制T细胞和B细胞增殖；(4)抑制巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞的活性[17]。

1.4.2 溶细胞抑制 Treg细胞可产生一种丝氨酸蛋白酶称为颗粒酶B。当Treg 直接与效应细胞接触时，可通过胞吞的作用释放富含穿孔素和颗粒酶B的颗粒，穿孔素将自身插入靶细胞的脂质膜中，并在钙离子存在的情况下聚合形成跨膜圆柱体，每个圆柱体形成一个孔，颗粒酶B可通过该孔进入细胞，一旦进入靶细胞内，粒酶B通过胱天蛋白酶依赖的或独立的机制诱导靶细胞凋亡[18]。

1.4.3 代谢破坏抑制 Treg可通过增加效应T细胞中环磷酸腺苷(cAMP)的水平，从而控制T细胞的增殖和细胞因子产生。Treg介导cAMP的抑制主要通过两种机制：(1)Treg介导的cAMP通过间隙连接流入靶细胞;(2)存在于Treg表面上的外切核酸CD39和CD73将三磷酸腺苷转化为腺苷。此后，腺苷再与靶细胞表面的受体结合，导致这些靶细胞内cAMP水平升高[19]。

1.4.4 通过下调CD80和CD86的水平来抑制树突状细胞的成熟或功能 树突状细胞通过识别、获取、加工和呈递外源抗原和自身抗原，以启动T细胞活化。树突状细胞表面存在CD80/86,与共刺激信号CD28结合后促进DC的成熟及抗原提呈能力。Treg细胞高水平表达CTLA-4，Qureshi等表明，CTLA-4可以通过胞吞作用从树突状细胞捕获配体CD80和CD86，这些配体进入Treg细胞后进行降解从而导致树突状细胞表面的CD80/86下调[20]。

2 Treg与MG

2.1 Treg和EAMG的关系 实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)是通过相关抗原免疫动物而建立的适用于研究重症肌无力的临床表现和发病机制的动物模型。Gertel等学者研究发现与单纯用磷酸盐缓冲液和完全弗氏佐剂免疫的健康对照组大鼠相比，EAMG大鼠的脾脏和外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量减少及抑制效应T细胞和B细胞增殖能力降低。此外，这项研究还发现来自EAMG大鼠的Treg细胞具有更明显的凋亡程度[21]。Aricha等学者研究发现离体产生的源自健康供体的外源性Treg细胞抑制了EAMG的发生发展，还可以使体液中乙酰胆碱受体抗体介导的特异性反应下调[22]。此后，另有研究表明从EAMG大鼠自身离体扩增功能性Treg细胞，向EAMG大鼠重新给予上述扩增的自体功能性Treg细胞也可抑制EAMG的进展[23]。这些研究高度提示EAMG的Treg细胞的数量减少及活性降低。

2.2 Treg和MG患者的关系 Balandina等学者及WenHua等学者分别在2005年和2017年均通过研究发现MG患者的CD4+CD25+Treg细胞数量较健康对照组未见明显下降，但其调节功能出现严重的缺陷，同时对T细胞调节功能至关重要的转录因子Foxp3的表达下降[24]。有学者采用流式细胞仪检测MG患者和健康对照者的外周血CD4+CD25+Treg细胞，结果发现MG患者和健康对照组之间的CD4+CD25+Treg细胞百分比虽无明显差异，但症状控制不佳的MG患者CD4+CD25+Treg细胞百分比症状较稳定的MG患者低，这表明CD4+CD25+Treg可能与MG的疾病稳定性有关[25]。滤泡辅助性T(Tfh)细胞主要功能是辅助B细胞增殖和促进B细胞产生抗体。卵泡调节性T(Tfr)细胞定义为位于生发中心的Treg的一个子集，Tfr细胞可以抑制生发中心B细胞和Tfh细胞的增殖，因此，Tfr与Tfh细胞在体内免疫方面具有相互拮抗的功能，Yanbin等学者研究观察到与健康对照组和经糖皮质激素治疗的MG患者相比，未经治疗的MG患者Tfr/Tfh细胞比率降低，此外还观察到经糖皮质激素治疗的MG患者的循环Treg和Tfr样细胞的频率增加，而循环Tfh样细胞的频率减少[26]。Kohler等发现胸腺瘤相关性MG患者的胸腺瘤组织中可以观察到较低数量的Treg[27]。Thiruppathi等学者通过体外增殖实验发现健康受试者的Treg可以更有效地抑制效应T细胞，而MG患者的Treg抑制效应T细胞的能力降低，此外他们还通过RT-PCR测定了Foxp3的信使RNA(mRNA)表达水平，发现MG患者的CD4+CD25+Treg细胞中FOXP3 mRNA水平与健康对照组相比也显着降低[28]。上述研究表明MG患者体内功能性Treg数量减少，或者是表达Foxp3的Treg细胞的数量减少可能是MG的发病机制之一。

2.3 Treg与MG的治疗 目前有研究发现将GM-CSF治疗EAMG小鼠可延缓EAMG疾病的进展，同时观察到小鼠体内Treg细胞数量增多及FOXP3的表达增加[29]。Bhattacharya等发现GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞可以通过细胞因子依赖和接触依赖性机制扩增nTreg并诱导iTreg[30]。在临床上Rowin等学者将GM-CSF运用于一位难治性肌无力危象的患者，观察到该患者临床症状改善，Treg细胞循环数量的增加以及Treg中Foxp3表达水平增加[31]。有研究发现GM-CSF治疗可通过增殖Treg以抑制慢性移植物抗宿主病[32]。此外另有研究发现低剂量的GM-CSF治疗可以预防实验性Ⅰ型糖尿病和自身免疫性甲状腺炎等自身免疫性疾病的发展[33]。近年来，维生素D(VitD)已被证明与自身免疫疾病有关，例如多发性硬化症和牛皮癣等。Kang等发现MG患者与健康对照组相比，MG的血清VitD水平较低[34]。其作用机制可能为：(1)Treg表达VitD受体，在健康个体体外可诱导产生Treg，促进Foxp3的表达及增加IL-10分泌细胞的数量[35]；(2)VitD3在抗原提呈水平可能对Treg具有诱导作用[36]。此外有研究报道大剂量VitD治疗MG患者可诱导疾病缓解[37]，但需要进一步的研究假设及补充维生素D的长期安全有效数据。越来越多的证据表明改变肠道微生物的组成可影响免疫系统的活化并驱动促炎和抗炎反应促进自身免疫性疾病的发展。Alessandra和Elena等发现口服益生菌(包括双歧杆菌和乳酸杆菌)可有效调节EAMG和实验性自身免疫性脊髓炎疾病，其潜在机制可能为升高外周血Treg细胞的百分比和血清中TGF-β，促进未成熟的树突状细胞向免疫调节表型成熟[38]。因此，益生菌诱导Foxp3+Treg似乎可用于治疗包括MG在内的自身免疫性疾病。雷帕霉素是一种临床上用于治疗自身免疫和移植排斥的免疫抑制药物，有研究表明雷帕霉素可通过抑制Th17细胞的糖酵解及促进Treg细胞的脂肪酸氧化以 降低Th17细胞和增加Treg细胞在体内的比例。另有研究表明雷帕霉素可通过上调自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的TGF-β/Smad信号传导减轻炎症反应。这些信号通路可以为MG治疗中Treg的控制提供新的靶分子。

3 展 望

随着对Treg细胞的研究日趋深入，包括它的发育分化、表面分子标志、分群、在各种自身免疫性疾病的进展及治疗的应用，并发现其与MG的发生、发展密切相关，但仍然还有许多深层次的问题需要更多研究加以阐明。首先，除了Foxp3外还需要探索Treg更为特异性的表面标志物及其在Treg上的具体作用机制；其次，对于通过增加Treg细胞的数量及功能在临床上对于MG的治疗还存在很多争议并缺乏长期安全有效的数据，需进一步开展相关临床实验研究Treg对于MG治疗的可行性及发挥Treg免疫调节作用所需的条件。因此，这些问题的解决对于MG的治疗具有重要意义。