反义寡核苷酸在中枢神经系统退行性疾病中的作用研究进展

孙姜瑾，李 鸣，刘亚奇综述，杨 薇审校

中枢神经系统退行性疾病(central nervous system degenerative disorders)是一组原因不明的慢性进行性损害中枢神经系统的疾病总称，主要包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等，大多是神经组织在衍化、发育、成熟、衰老等过程中在分子生物学水平上发生一系列复杂变化。神经系统退行性疾病是一类由环境与遗传等多种因素共同影响的疾病，其主要特征在于一些特定的蛋白错误折叠并聚集于细胞中导致神经元变性、坏死[1]。PD、AD、HD和ALS等可见中枢神经系统异常RNA和蛋白质的聚集[2～6]。消除异常聚集RNA的毒性和错误蛋白的折叠，已经被证实能够改善退行性症状[7]。但是，部分非特异性靶向蛋白治疗因同时损害了正常非突变蛋白的功能，在改善退行性症状的同时，可能伴有正常生理功能的缺失[8]。目前，除了有临床批准的可延缓帕金森病病情进展的治疗方案外，此类疾病仍然缺少有效的控制手段。

反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)是一类可与特定的RNA通过碱基互补配对原理结合，从而引起基因转录或者翻译改变的单链核苷酸。ASOs能够精准作用于靶向基因转录产物，并且ASOs能够透过血脑屏障，作用于中枢神经系统[9,10]。ASOs在动物和人体试验中取得了良好的结果。在动物试验中，ASOs可靶向突变基因，减少突变基因异常扩增或者错误转录翻译导致的聚集性RNA和蛋白质毒性[5,6,10～14]。在人体试验中的临床试验Ⅰ～Ⅱ期结果表明，一定剂量范围内的ASOs可在减少HD和ALS突变蛋白表达的同时，没有表现出严重的不良反应[15,16]。

ASOs可调控转录RNA和翻译蛋白质的稳态，在分子水平干预错误蛋白的发生以及聚集，减轻疾病的病理性进展程度。ASOs具有的这些特性为神经系统退行性疾病的治疗提供了理论基础[5,6,10～14,17]。动物和人体试验为ASOs的临床应用提供了实践的积累[4～6,13,15,16,18]。本综述主要总结ASOs治疗中枢神经系统退行性疾病的研究进展。

1 ASOs治疗帕金森病研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以黑质多巴胺神经元变性死亡为主要特征的神经系统退行性疾病。临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直及姿势平衡障碍。人群特征方面，男性帕金森病发病率高于女性。虽然环境因素与帕金森病关系密切，单基因或基因组学研究表明，编码α-突触核蛋白和Leucine-rich repeat kinase 2的SNCA和LRRK2基因的突变，会导致蛋白异常聚集和蛋白转运障碍。病理特征方面，帕金森病个体内残存的神经元胞浆内可出现以α-突触核蛋白为主要成分的嗜酸性包涵体。遗传性帕金森病最常见的突变是LRRK2，而α-突触核蛋白异常聚集和沉积是影响PD发病以及进展的关键步骤[19]。因此，调控异常蛋白的转录和翻译水平，能够减少甚至逆转异常蛋白的聚集，恢复相应蛋白的功能。

ASOs可诱导性地调控靶向目的基因的转录，从而调控蛋白的表达和功能。在帕金森病的ASOs治疗中，针对LRRK2和α-突触核蛋白的研究已经取得了初步的成果。ASOs能够诱导过表达的α-突触核蛋白在一定范围的下调，既能减轻因α-突触核蛋白表达异常带来的毒性作用，又不会因α-突触核蛋白功能缺失导致的生理活动障碍。同时ASOs可选择性地调控LRRK2激酶活性，从而调节线粒体功能、自噬，甚至可与α-突触核蛋白协同作用，减少帕金森病的病理学改变[20,21]。

Alarcan-Aris等[20]人将siRNA、ASOs与单胺再摄取抑制剂偶联的分子经鼻腔内给药后可选择性地降低小鼠中脑黑质致密区、腹侧被盖区、背侧缝核和蓝斑单胺核团中的α-突触核蛋白表达。选择性地α-突触核蛋白敲低20%～40%能够增强前脑多巴胺和五羟色胺的释放，并且不引起单胺神经元的退行性病变。总之，通过鼻内给药可获得的细胞选择性和功效表明，ASOs可能是减少单胺类神经元中α-突触核蛋白表达的新方法，在帕金森病治疗中具有很大的发展潜力[20]。

此外，LRRK2的显性遗传突变是家族性和散发性PD最常见的遗传病因。Zhao等[21]发现ASOs介导的LRRK2抑制可预防小鼠体内病理性α-突触核蛋白的形成，并且可以减轻多巴胺能神经元丢失的程度，改善α-突触核蛋白介导的运动缺陷。与普通LRRK2激酶抑制剂不同，在治疗剂量大致相同情况下，颅内注射ASOs不会影响外周器官(例如肾脏、肺脏)中LRRK2的水平，避免与LRRK2抑制相关的周围组织的潜在副作用[21]。表明ASOs介导的LRRK2抑制可能是治疗PD的潜在疗法。

同时，由于帕金森病发病率的性别差异，Lee等[22]发现性别决定相关基因(SRY)参与调节雄性大鼠黑质多巴胺能的合成。ASO调控的选择性SRY表达下降会削弱帕金森大鼠的运动障碍和多巴胺能神经元的丢失。ASO的良性作用在于其能减少雄性相关性的DNA损伤、线粒体老化和神经免疫异常。并且，SRY特异性ASO能减小甚至消除帕金森模型大鼠在黑质纹状体结构功能、DNA损伤和神经免疫的性别差异[22]。

综上所述，目前的研究表明，针对帕金森病的ASOs已经在临床前取得了一些成果。其作用机制主要在于调控α-突触核蛋白和LRRK2基因的表达，降低异常蛋白毒性，并且尽量保留未病变蛋白的生理活性[20,21]。同时，选择性调低性别决定基因，或许能够降低男性的帕金森病发病风险[22]。

2 ASOs治疗AD研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的痴呆类型。其主要表现为发作性记忆和认知功能的逐步丧失，以及语言和视觉空间能力不足，并常常伴随着行为障碍，例如冷漠，攻击性和沮丧等。其组织病理学表现为细胞外以β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)沉积为核心的神经炎性斑(neuritic plaque，NP)、细胞内以高度磷酸化的tau蛋白螺旋化为主的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)和神经元缺失以及胶质增生[3]。其中，Aβ的生成与清除失衡及高磷酸化的tau蛋白是发病的主要原因。在世界人口老龄化的背景下，阿尔茨海默患者的发病率和患病率持续增加，并且已经成为了影响居民健康和生存时间的前位危险疾病[3]。因此，寻求一种有效的治疗方法已经迫在眉睫，而ASOs因其可定位并且定量的特点，在阿尔茨海默病的临床前试验中取得了一定的成效。

Aβ生成与清除障碍是Aβ沉积并且发挥毒性的基础，也是导致认知功能下降的病理学基础。因此靶向Aβ一直是寻求治疗AD的重要方法。Aβ是由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)剪切产生。Chang等[9]证明了一种选择性不表达剪接Aβ所需的蛋白水解位点的可变剪接反义寡核苷酸(SSOs)，可使表达的APP蛋白缺少水解Aβ所需的蛋白水解必须片段，从而广泛减少小鼠颅内Aβ的产生。此实验中的SSOs有2’-O-甲氧基乙基核糖核苷酸和硫代磷酸酯修饰的骨架，为水溶性，对核酸外切酶具有对抗性，并且可高度扩散。可以通过脑室内注射至大脑，从而靶向目标细胞。以这种方式提供的SSOs具有广泛的分布和吸收能力及有效的作用时长。Aβ除了生成过程的异常外，还可能存在清除障碍。同时，PSEN1基因的突变，是早发型阿尔茨海默最常见的致病因素。PSEN1编码的早老素蛋白是γ-分泌素的主要组成成分。PSEN1的突变可能会增加Aβ的异常生成与沉积。Fiorini等[10]发现，在应用针对PSEN1的ASO之后，可导致SAMP8体内的氧化应激产物减少，并且能够逆转衰老小鼠学习和记忆功能的下降。此实验证明了使用ASOs干预Aβ的表达是治疗AD的潜在方法。

tau蛋白是由17号染色体上的微管相关蛋白tau基因(MAPT)编码。ASO可选择性降低人源MAPT 突变小鼠的tau蛋白水平，并且能够预防神经元的丢失和逆转病理性tau蛋白的聚集和沉积[4]。鞘内注射ASOs后，P301S tau突变小鼠表现出tau沉积的形成减少、现有tau病理结构得到逆转、以及海马神经变性的减少。鞘内注射后，tau ASOs也会分布于食蟹猴的整个大脑和脊髓，并同时伴有脑和脊髓液中的tau mRNA和蛋白质水平的下降[4]。Tau 特异性的ASOs在小鼠和非人类灵长动物的成功或许能够为ASOs在阿尔茨海默的成功奠定坚实的基础。

阿尔茨海默病也有相当程度的代谢改变，并且代谢相关基因的突变也在疾病的发生发展过程中起到重要作用。糖原合酶激酶3β(GSK-3β)与tau蛋白的磷酸化密切相关，GSK-3β的异常参与阿尔茨海默病的进展。Farr等[12]发现针对GSK-3β特异磷酸化修饰位点的ASO可缓解SAMP8(非转基因)和Tg2576(APPswe，转基因)小鼠学习和记忆的缺失。Apolipoprotein E(APOE)是一种与脂质代谢相关的蛋白，APOE-ε4突变是晚发型阿尔茨海默病危险因素。直接作用于APOE或者其受体的ASOs已经成功逆转或者缓解阿尔茨海默小鼠模型的病理学改变，同时可伴有认知功能的改善[13,14]。虽然ApoER2(APOE受体2)的功能并不明确，但Hinrich的研究表明，ASO可通过选择性剪接ApoER2外显子来更正受体功能。脑室内单次ASO诱导的外显子可变剪接能够提高小鼠的突触功能和学习记忆长达半年之久[13]。而直接针对APOE的ASOs研究表示，对于APP/PS1-21小鼠中，ASOs起始作用时Aβ的病理状态，影响了ASOs的效能。Huynh的研究表明，在Aβ病理性斑块沉积前应用ASOs能够极大地减少Aβ的病理毒性。然后在Aβ沉积后应用ASOs可能会增加Aβ斑块的大小和毒性[14]。因此，ASOs作用于代谢相关的基因，也可能会影响Aβ和tau的病理变化。

阿尔茨海默病主要的病理基础是Aβ的生成与清除障碍和tau蛋白异常磷酸化导致的异常蛋白沉积。因此，目前旨在缓解阿尔茨海默病的ASOs主要靶点是在减少异常Aβ和tau蛋白的产生，同时减轻异常蛋白沉积导致的毒性作用[4,9,10]。除此之外，作用于代谢相关的酶或者配体受体同样可能会对几种神经系统退行性病作用[12～14]。虽然针对阿尔茨海默病的ASOs揭示临床试验结果，但从目前的情况看，动物试验能够缓解阿尔茨海默的症状。

3 ASOs治疗HD研究进展

亨廷顿病(Huntington disease，HD)是一种常染色体显性遗传的神经系统退行性疾病。临床上以运动障碍、认知障碍和精神异常为特点。目前认为本病是由(Huntingtin，HTT)异常扩增的CAG重复序列所引起，这导致翻译过程中产生了亨廷顿蛋白突变体(mutant Huntingtin，mHTT)。因此，在分子水平上减少HTT基因的转录和翻译，从而限制突变型HTT产生下游的毒性效应，有助于减缓、阻止或逆转HD病理和症状的进展。值得鼓舞的是，临床前试验的结果表明ASOs可靶向调控HTT基因的RNA转录，降低mHTT的毒性，并且临床试验初级阶段也证实ASOs应用于亨廷顿患者有效性和耐受性[6,11,16]。

目前正在探究两种不同的ASOs治疗策略：使野生型和突变型都减少的亨廷顿蛋白非选择性治疗及以异常扩增的CAG重复序列为靶点的选择性治疗。等位基因非选择性治疗的优势在于该方法可用于所有HD患者，而等位基因选择性治疗仅适用于一部分HD患者，因而需要多种等位基因选择性药物来治疗整个HD人群。但是等位基因非选择性治疗会在降低突变亨廷顿蛋白的同时，会导致正常亨廷顿蛋白的下降，从而引起亨廷顿蛋白缺失导致的生理功能缺损。考虑到非选择性地剔除亨廷顿蛋白会造成严重的不良反应，目前测试ASOs对亨廷顿疾病的试验都是选择性针对mHTT的[6,7,11,16,23]。

等位基因选择性ASOs沉默mHTT在临床前实验动物体内及体外取得了初步的疗效。正常亨廷顿基因CAG重复扩增的次数一般不超过35个，而mHTT的CAG重复扩增次数多于40个。Ostergaard等[23]通过将ASOs特异识别与mHTT异常重复扩增相关的单核苷酸多态性的位点结合，并沉默这些位点，选择性抑制了mHTT的mRNA及蛋白水平。等位基因选择性ASOs的注射，改善了小鼠的认知和行为学缺陷，并且在小鼠和食蟹猴或恒河猴中枢性应用ASOs后，mHTT水平的降低，广泛见于调节认知和情绪控制的中枢[6,7]。而且，将特异性识别mHTT的ASOs注射到正常小鼠的中枢神经系统内，并没有引起明显的不良反应，也说明了等位基因选择性ASOs的有效性和良好的耐受性[23]。再者，与完全HTT敲除的小鼠相比，ASOs不仅延缓了疾病的进展，而且有些逆转的病理表现持续时间更长[6]。

同时，选择性针对mHTT水解后的片段产物也取得了良好的成果。相比于完整的亨廷顿蛋白，氨基端的亨廷顿蛋白片段具有更强的毒性。重要的氨基端水解片段是亨廷顿蛋白的外显子12表达，因此选择性沉默外显子12的表达可能会抑制亨廷顿蛋白的水解，从而降低突变蛋白的毒性。Evers等[11]发现纹状体定位注射可造成外显子12不表达的ASOs后，翻译的亨廷顿蛋白的缺少了外显子12的表达，缺少了被水解的标记，从而降低了突变亨廷顿蛋白的毒性。

鉴于ASOs在非人类动物治疗HD的可能性，针对HD患者的ASOs临床试验也取得了初步的成果。IONIS-HTT Rx是第二代反义寡核苷酸，旨在降低HTT信使RNA(mRNA)的浓度。IONIS-HTT Rx通过Watson-Crick碱基互补配对与其同源mRNA结合，从而触发RNase H1介导的靶mRNA降解[16]。Tabrizi等[16]的随机双盲Ⅰ～Ⅱ期试验表明，在一定的浓度范围内，突变亨廷顿蛋白的下降与鞘内注射的IONIS-HTT Rx剂量呈现出浓度依赖性。IONIS-HTT Rx可有效降低突变亨廷顿蛋白的浓度，并且没有引起严重的不良反应。

亨廷顿病是一种由亨廷顿基因异常重复扩增导致的神经系统退行性疾病。亨廷顿基因的异常扩增既可能会导致病变基因转录正常RNA和翻译正确蛋白质能力的减弱，也可能因异常翻译的蛋白质产生病理性毒性。动物试验和临床试验表明，等位基因选择性ASOs兼具有效性和良好的耐受性[6,7,11,16,23]。

4 ASOs治疗ALS研究进展

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种运动神经元病，主要表现为肌无力、肌萎缩及锥体束征。此病大多为散发，遗传方式主要为常染色体显性遗传。已知有20余种基因可导致该疾病，最常见的致病基因是21号染色体上的铜(锌)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，SOD-1)及9号染色体上的C9ORF72基因。一个基于意大利ALS人群的研究发现，将近10%的ALS患者携带ALS相关基因突变。并且在这些突变中，C9ORF72与SOD-1是最常见的突变基因[18]。突变的SOD-1和C9ORF72可导致相关RNA和蛋白质稳态的失衡，促进了ALS的发生与发展。因此，针对突变SOD-1和C9ORF72的反义治疗策略意义重大[5,24,25]。

SOD-1相关性突变是肌萎缩侧索硬化最常见的遗传危险因素之一[18]。目前认为SOD-1基因突变的致病机制并非是SOD-1功能缺陷，而是突变后SOD-1促氧化作用增强，同时由于错误折叠产生异常聚集进而对前角运动神经元产生毒性作用。考虑到SOD-1具有毒性的功能获得作用，因此降低SOD-1的水平具有治疗作用。Winer等[26]发现，将ASOs作用于表达人类SOD-1基因的小鼠，可有效降低脑组织SOD-1 mRNA和SOD-1蛋白水平的表达。此外，McCampbell[27]等人通过实验研究发现降低SOD-1的ASOs可以显著延缓疾病的发作，并延长模型动物的生存期。并且，脑脊液SOD-1水平与ASOs应用密切相关。临床研究方面，Tofersen，一种靶向SOD-1的ASOs的Ⅰ～Ⅱ期试验已经取得了初步的成果。在一定的剂量范围内，Tofersen的剂量与脑脊液SOD-1下降的水平呈现一定的负相关性。而且，除了腰穿引起的不良反应和脑脊液细胞数增多外，没有发现与Tofersen应用直接相关的严重不良反应[15]。

C9ORF72基因非编码区GGGGCC六核苷酸重复序列的重复扩增是肌萎缩侧索硬化最常见的突变类型[18]。异常重复扩增的六核苷酸序列能够在核内外定位形成以RNA为主题的沉积物，消除RNA沉积物的影响会缓解因沉积物聚集导致的毒性作用。Lagier-Tourenne等[28]发现，特殊的ASOs在没有明显改变小鼠C9orf72 正常表达的情况下，减轻因核内RNA沉积物导致的毒性。同时期，来源于肌萎缩侧索硬化患者的神经细胞在经ASOs处理后，核内因六核苷酸重复扩增形成的RNA沉积物也被抑制[29]。C9ORF72基因变异链上的六核苷酸重复扩增导致的异常RNA在核内聚集被证明是导致神经细胞退行的重要原因[5,27,29]。Jiang等[5]证明，脑室内定向注射靶向重复扩增C9ORF72的ASOs可有效在保证正常C9ORF72基因功能的情况下，降低携带突变C9ORF72转基因小鼠的错误RNA和蛋白质的表达水平。并且能有效改善由C9ORF72突变导致的行为学障碍。这为在未来的临床研究中靶向ALS中的C9ORF72建立了基础。

由于肌萎缩侧索硬化患者多数是散发型，很大一部分的患者并不具有特异性的基因突变，因此ASOs特异性靶向突变基因对肌萎缩侧索硬化有很大的局限。TDP-43，一种转录相关蛋白的突变几乎见于所有的肌萎缩侧索硬化的患者中。Becker等[25]发现通过单剂ASOs特异性降低ataxin-2的表达可有效地降低TDP-43的无效聚积，同时极大地延缓了TDP-43小鼠的寿命。一种能广泛作用于所有肌萎缩侧索硬化的治疗手段或许在未来会更加具有优势。

综上所述，ASOs在肌萎缩侧索硬化动物试验和临床试验中都取得了不错的成效。在动物试验中，ASOs可改善因SOD-1或C9ORF72基因突变导致的转录的RNA或翻译的蛋白质毒性作用[5,26,28,29]。并且，临床试验显示，靶向SOD-1的ASOs在临床试验早中期证明了治疗的有效性和可耐受性[15]。同时，由于无遗传特殊性肌萎缩侧索硬化患者的普遍性，作用于更加肌萎缩侧索硬化患者更加普遍的病理，或许更加具有优势[25]。

5 总 结

中枢神经系统退行性疾病是一类以特异性神经元丢失为特征的不可逆转性疾病，除帕金森病外，阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化缺少良好的药物管理方式[2,19]。帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化所拥有的共性是有异常蛋白质或者RNA的聚积导致的神经元变性。因此，特异性作用于错误转录和翻译这些RNA或蛋白质的基因是一个不错的选择[3,19]。ASOs作为一种能够定位定量作用于中枢神经系统的新型治疗方法，不仅能够提升药物的有效利用率，同时也减少了因进入外周屏障导致的不良反应。一般来说，ASOs具有良好的中枢神经系统透过作用，能够更加特异性地作用于病变部位。同时ASOs还可以特异性作用于神经元核内的异常RNA聚积，减少神经元的衰亡[4～7,11,13,14,26]。

基础研究突出了反义技术在神经系统退行性疾病治疗中的巨大潜力，有望为神经系统退行性疾病的治疗带来希望。