中药通过调控miRNAs抑制动脉粥样硬化内皮细胞及巨噬细胞炎症反应的研究进展

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作为心肌梗死、心绞痛、心力衰竭等疾病的主要病理过程，目前已成为全球死亡的首要原因[1]。动脉粥样硬化发病机制与免疫炎症反应、脂质代谢、氧化应激、细胞凋亡以及血流动力学改变等有关[2]，其特征是血管壁中存在低密度脂蛋白胆固醇沉积和泡沫细胞的形成[3]。miRNAs是一种常见的非编码RNA，研究发现，miRNAs通过调控内皮细胞(endothelial cell，EC)炎症应答、机体免疫激活、巨噬细胞表型转化等参与动脉粥样硬化斑块发生、发展的全过程[4]。

1 动脉粥样硬化与炎症反应

单核细胞及巨噬细胞的炎症反应和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)刺激单核细胞、巨噬细胞吸收脂质是动脉粥样硬化发生的基础[5]。研究表明，动脉粥样硬化的发生发展可分为3个阶段：第一阶段，动脉血管内皮细胞被高血脂、氧化应激等有害刺激激活，进而产生黏附分子，导致大量的白细胞黏附。与此同时，由于内皮通透性增加以及内皮下细胞外基质成分的改变，促使集聚在动脉壁上的已经被清道夫受体识别的ox-LDL，进入巨噬细胞形成泡沫细胞[6]；第二阶段，EC分泌的细胞因子和生长因子，诱导平滑肌细胞增殖和迁移，形成由纤维组织、平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞构成的纤维帽；第三阶段，病理血管内，受到损伤的EC与大量泡沫细胞、脂质、钙质沉积等共同构成斑块的核心[7]。

在促进动脉粥样斑块的形成在动脉粥样硬化的发生发展中，炎症反应起到关键的作用。其机制可能为：①内皮细胞炎症反应能增强EC的活化、促进更多细胞黏附分子的产生，形成大量的泡沫细胞，通过募集更多的脂质成分使得脂质核心体积不断地增大；②巨噬细胞炎症反应能导致巨噬细胞增殖、活化增强，并能分泌大量的炎性细胞因子，炎性细胞因子能促进平滑肌细胞迁移和增殖，最终降低斑块的稳定性。

2 miRNAs生物学特点以及作用机制

miRNAs是一组长约22个核苷酸的非编码小RNA，—般位于内含子区和其他基因的间隔区域，通过碱基配对的方式结合目标mRNA抑制目的mRNA翻译或将其直接分解，其表达水平的改变能够调节许多心血管疾病发生发展[8-9]。miRNAs是由最原始pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA，即microRNA前体，pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为成熟的miRNA，成熟miRNA在3'端非编码区域(3'UTR)与靶基因mRNA分子特异性结合，在转录后水平降解mRNA或者抑制mRNA的翻译，从而来调节基因表达，其表达具有组织特异性[10-12]。

miRNAs通过影响基因调控不同的蛋白表达，当其表达异常或功能失调可导致疾病的发生[13]。miRNAs可能参与了ox-LDL刺激下单核/巨噬细胞的多种生物学功能调控，是动脉粥样硬化免疫炎症病理过程中关键性的调控分子[14]。miRNAs可能具有调节单核细胞/巨噬细胞募集到生长病变，以及调节巨噬细胞向促炎症或抗炎症表型极化的能力[15]。

3 调控动脉粥样硬化过程中相关细胞炎症反应的miRNAs及其机制

3.1 调控血管内皮细胞的炎症反应

3.1.1 抑制内皮细胞炎症反应的miRNAs 在动脉粥样硬化班块形成过程中，血管内皮细胞受损是启动炎症反应的始动环节。在动脉粥样硬化过程中，血管内皮细胞受核因子-κB(NF-κB)的诱导，分泌的细胞间黏附因子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)以及单核细胞驱化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)能在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)的作用下，分化成为巨噬细胞[16]。且有研究表明，VCAM-1在活化的内皮细胞中高度表达，能促进白细胞向内皮细胞的黏附，并促进单核细胞迁入内膜，摄取ox-LDL转化为巨噬细胞源性泡沫细胞，从而促进血管损伤诱导的免疫炎症反应[17]。

miR-126在血管内皮细胞特异性高表达，VCAM-1是miR-126的靶基因。miR-126通过结合VCAM-1 mRNA 的非编码区，抑制VCAM-1的表达，减轻白细胞向内皮细胞的黏附，从而抑制炎症反应，发挥在动脉粥样硬化的发展过程中的保护作用[18]。有研究表明，趋化因子配体12(CXCL12)的受体CXCR4受到重组人G蛋白信号转导调控因子16(RGS16)的负调控。miR-126可通过减少RGS16的表达水平，促进EC中CXCL12的表达，减少炎性细胞聚集，形成更稳定的斑块，发挥抑制动脉粥样硬化发展的作用[19]。

miR-181b可通过间接靶向抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)诱导的VCAM-1表达，抑制动脉粥样硬化斑块的形成。TNF-α是参与动脉粥样硬化发生发展的炎性细胞因子之一，其能诱导EC活化产生VCAM-1，导致大量炎症细胞聚集于内皮，通过氧化应激反应使EC凋亡并产生炎症反应，还能诱导NF-κB入核。在ApoE-/-小鼠的主动脉内膜细胞中miR-181b与颈动脉内皮细胞caspase 募集结构域蛋白10(caspase recruitment domain family member 10，Card 10)的表达均呈负相关。Card 10的低表达，可特异性下调NF-κB核转位作用，进而导致白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、TNF-α的失活，诱导型一氧化氮合酶、细胞黏附分子-1、VCAM-1、环氧化酶-2(cyclooxygenase，COX-2)等细胞因子表达的下调，从而抑制炎性反应的发生[20]。

3.1.2 促进内皮细胞炎症反应的miRNAs miR-34a 可通过拮抗沉默信息调节因子2相关酶 1(sirtuin1，SIRT1)加速EC老化，EC的老化是动脉粥样硬化发生的关键环节。其机制是miR-34a可通过抑制SIRT1、激活内皮祖细胞转录因子叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1，FOXO1)而引起内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC) 老化。SIRT1是一种具有EC保护功能的去乙酰化酶，其抗老化、抗凋亡是通过催化EC及FOXO1去乙酰化，令老化相关基因转录失活以及上调锌指样转录因子2(KLF2)，促进内皮保护因子的生成[21-22]。EPC是EC的前体细胞，在血管损伤与修复过程中发挥着重要作用，能抑制动脉粥样硬化进程。Guo等[23]发现，上调miR-34a可抑制SIRT1，引起VCAM-1、ICAM-1及 IL-6生成，促进EC炎症反应。Fan等[24]发现，miR-34a 可激活NF-κB信号通路导致血管炎症发生，促进ICAM-1和VCAM-1等炎性因子的分泌。

miR-21通过靶向结合E3泛素连接酶1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1)的3′-非转录区抑制 WWP1的表达，抑制 EPC的增殖，发挥诱导动脉粥样硬化的作用[25]。Zhou等[26]在人脐静脉内皮细胞中运用振动剪切应力技术诱导miR-21的表达，其研究结果表明miR-21能通过促进VCAM-1、MCP-1等黏附分子的表达，增加单核细胞在EC上的黏附聚集。

3.2 调控巨噬细胞的炎症反应 动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞积极参与脂蛋白的摄取和积累。巨噬细胞向两种细胞亚型分化的过程被称为巨噬细胞极化，巨噬细胞极化是炎症反应中的重要环节[27]。巨噬细胞通常分化为M1和M2两种类型，其中M1型巨噬细胞可促进炎症反应亦可称为经典活化，而M2型巨噬细胞则可抑制炎症反应亦可称为选择性活化[28]。巨噬细胞极化受细胞因子以及趋化因子等因素的调节，其中M-CSF和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF) 是诱导单核巨噬细胞极化的关键调节因子。

促炎M1巨噬细胞表型具有促动脉粥样硬化斑块形成的作用，其活化可分泌促炎细胞因子和细胞毒性物质，通过内质网(endoplasmic reticulum，ER)的应激途径，这些物质成为动脉粥样硬化的早期诱导物。GM-CSF能诱导巨噬细胞极化为M1型，GM-CSF诱导的M1型巨噬细胞在受到脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)的信号转导途径被激活，能因此产生更多的肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)和白细胞介素-23(interleukin-23，IL-23)等炎症细胞因子，维持并促进血管炎症反应[29]。C反应蛋白(C-reacyiveprotein，CRP)、LPS、TNF-α、IL-12 等因子可诱导巨噬细胞极化为M1型[30]。抗炎M2巨噬细胞表型具有能抗动脉粥样硬化的作用，其活化后分泌转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)等抗炎细胞因子实现抑制炎症反应、促进新生血管生成以及血管修复等作用[31]。M-CSF、TGF-β、白细胞介素-4(IL-4)、IL-10、白细胞介素-13(IL-13)等因子可诱导巨噬细胞向M2型转化。有研究表明，在未受刺激的巨噬细胞内MAPK处于静止状态，当受到损伤时MAPK因发生磷酸化被激活，IL-4可通过抑制MAPK信号通路来诱导巨噬细胞向M2型极化，从而抑制炎症反应[32]。

miR-155是与炎症有关的最突出的基因之一，可特异性表达于动脉粥样硬化斑块处巨噬细胞中，其可通过调节相关靶蛋白调节炎症通路介导动脉粥样硬化中的炎症[33]。有研究表明，巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，c-Fms)是原癌基因fms编码的产物，属于Ⅲ型酪氨酸激酶家族。c-Fms可参与调节相巨噬细胞的增殖、生长、分化过程。miR-155可靶向作用于c-Fms抑制单核细胞向巨噬细胞的转化，延缓动脉粥样硬化的进程[34]。还有研究表明，miRNA-155可直接作用于钙调控热稳定蛋白(calcium-regula-tedheatstableprotein 1，CARHSP1)，实现调节TNF-α的稳定性，减少巨噬细胞引发的炎症反应，发挥抗动脉粥样硬化的作用[35]。同时有研究显示，miRNA-155可通过降低NF-κB和黏附分子的表达，抑制巨噬细胞黏附到EC上，产生抗炎作用。

有研究发现，miR-125a-5p能够抑制炎性巨噬细胞的活化，在M2型巨噬细胞中miR-125a-5p的表达量也相对高于M1型巨噬细胞。Chen等[36]利用转染技术导入miR-125a-5p抑制剂后，能导致炎症因子如白细胞介素-2(IL-2)、IL-6、TNF-α表达水平增加，与此同时巨噬细胞的清道夫受体表达也上调，由此导致脂质摄入增加，表明miR-125a-5p发挥着抑制动脉粥样硬化的作用。氧类固醇结合蛋白9(oxysterol binding protein-like 9，ORP9)是一种细胞内的脂质受体，miR125a-5p通过抑制ORP9的表达起到抑制巨噬细胞中多种炎症因子的分泌的效果，而该过程有可能起到了抑制动脉粥样硬化发展的作用[37]。

miR-146a可能通过靶向抑制NF-κB信号级联反应，抑制巨噬细胞炎症M1极化和细胞的炎症激活从而减少动脉粥样硬化[38]。TLR4是病原相关的模式识别受体，能参与泡沫细胞形成过程并可以提高泡沫细胞在动脉粥样硬化中的炎性反应能力，发挥促动脉粥样硬化的作用。有研究发现，miR-146a能通过抑制TLR4信号通路，减少巨噬细胞分泌的炎症因子，可以达到抗动脉粥样硬化的效果。miR-33能靶向沉默腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)促进巨噬细胞向M2型极化，所以能够调节巨噬细胞的炎症反应，具有抗动脉粥样硬化的作用[39]。

4 中药通过miRNAs抑制动脉粥样硬化

中医古籍中没有与动脉粥样硬化相一致病名的记载，根据动脉粥样硬化相关疾病的证候，历代医家认为动脉粥样硬化多因情志不畅、饮食失节或素体不足引起脏腑气血阴阳失调，日久痰浊、瘀血等聚集发展而来，动脉粥样硬化相关疾病病位与心、脾、肝、肾相关，证属本虚标实，以脏腑气血阴阳亏虚为本，痰、瘀、火为标。有学者结合现代医学理论提出“脂浊”和“脉浊”观点，指出血脂为水谷精微之厚浊者，适量血脂可以营养身体，过量血脂则可化为脂浊而为邪为害[40]。近年来，随着对中医药防治动脉粥样硬化的研究不断深入，越来越多的研究表明，中药在动脉粥样硬化的防治方面显示出较大的优势及潜力。例如有研究表明通过长期服用丹参与葛根煎剂，能够抑制人源单核细胞分化的巨噬细胞泡沫化的形成，具有调控动脉粥样硬化早期关键环节的功效。

4.1 中药单体及有效成分 牡丹皮的活性成分丹皮酚(Paeonol，Pae)可通过上调miR-126 表达来抑制 NF-κB信号通路的激活，从而抑制VCAM-1的释放，抑制血管内皮细胞损伤后巨噬细胞的黏附[41]。研究发现，三七的活性成分三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，NR1)可使ApoE-/-小鼠体内的动脉粥样硬化斑块区域明显减少，使IL-2、IL-6、TNF-α炎症因子等明显下降，认为其机制可能与NR1能明显抑制miR-126的表达有关[42]。赖小华等[43]研究发现，NR1 调控miRNA-34a/SIRT1/p53 通路可能是其延缓EC衰老的机制。血管内皮损伤导致的EC 活化与炎性T淋巴细胞的增殖密切相关。虎杖中的活性成分白藜芦醇(resveratrol)，有研究证明其可通过调控miR-155的水平而减少炎症因子的释放、减轻EC的炎症反应[44]。 姜黄的活性成分姜黄素(Curcumin，Cur)，CD40和CD40配体广泛的表达于动脉粥样硬化中的巨噬细胞、平滑肌细胞等各种炎症细胞，激活CD40和CD40配体通路可增加白细胞介素-1(IL-1)、IL-6 等炎症因子的表达，引起剧烈的炎症反应，导致血管内皮功能障碍，促进动脉粥样硬化。miR-145丰富表达于血管平滑肌细胞，能调控血管平滑肌细胞的分化，可以抑制动脉粥样硬化的进程。研究表明，Cur可能通过调控miR-145的表达水平，从而靶向作用于CD40的mRNA，调控其mRNA或其蛋白的表达，阻断CD40和CD40配体通路，减少VCAM-1、ICAM-1的分泌，减轻EC的炎症反应，发挥抗动脉粥样硬化的作用[45]。

4.2 中药复方及中成药 麝香通心滴丸源于“至宝丹”，由麝香、人参、蟾酥、丹参、牛黄、熊胆粉、冰片等组成，具有益气通脉、活血化瘀、止痛的功能。Xiong等[46]研究发现，其抗动脉粥样硬化作用机制可能是麝香通心滴丸通过下调小鼠主动脉中miR-21达到调控TLR4/NF-κB的效果，进而抑制由LPS诱导巨噬细胞的炎症反应。冠心康源于《金匮要略》中瓜蒌薤白半夏汤，由生黄芪、丹参、赤芍、瓜蒌、薤白、制半夏、益母草等组成，全方共奏益气健脾、化痰泻浊、活血祛瘀之功。研究结果显示，冠心康能调控小鼠主动脉及血管EC中miRNA-126，靶向抑制RGS16以及VCAM-1的表达，减少炎性细胞招募以及白细胞向EC的黏附，参与血管EC修复，可以抑制动脉粥样硬化的发生发展[47]。

5 展 望

miRNAs在动脉粥样硬化炎症反应的发生发展过程中起着重要的调控作用，能通过调控miRNAs的表达水平，达到影响其靶基因和靶蛋白的功能的效果，可以为动脉粥样硬化的诊断及治疗提供新的思路。但在人类基因组中存在着上千种 miRNAs，目前被探索出来却只有几百种，且每一个miRNAs对靶基因、靶蛋白的调控机能仍在探索阶段。 中草药多源于天然植物，讲究配伍，与西药相比毒副作用较小，逐渐成为近年来的研究热点。但目前对中药复方具体作用机制的相关研究较少，虽然中药单体、中药有效组分具有作用靶点易于明确、作用机制易于阐述的特点，但是中药复方是中医临床治疗的最重要手段，仅从中药单体、中药有效组分难以全面诠释中医学的临床实际问题。因此，应该在传统中医理论的指导下，进行具有中医药特色的科学研究工作，深入探研中药通过调控miRNAs干预动脉粥样硬化的具体作用机制，尤其需加强对中药复方的研究深度和力度。进行中医药相关研究，不仅能进一步阐明中医药抗动脉粥样硬化的作用机制，丰富中医药学术理论，还能为防治动脉粥样硬化提供新思路与新的作用靶点。