泛素蛋白酶体途径在癫痫发病机制中的作用研究进展

张贺博 刘晓亮 赵彦艳

中国医科大学附属盛京医院临床遗传科，辽宁沈阳 110001

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，全世界约有7000 万人患有癫痫，其反复发作的特征对患者和家庭造成了沉重的负担[1]。虽然人们在癫痫发病机制方面做了大量的研究工作，但由于病因复杂，迄今为止癫痫发病机制仍未完全阐明。泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway，UPP）作为生物体内内源性蛋白降解重要途径之一，其功能失调与癫痫等神经系统疾病密切相关。本文就UPP 在癫痫发生发展中的作用展开综述。

1 UPP 的组成

UPP 由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、26S 蛋白酶体以及去泛素化酶（DUBs）组成。泛素是含有76 个氨基酸残基的小分子蛋白质，因其广泛分布于各种真核细胞及组织中而得名。E1是一种广泛表达的多肽，其结构和功能非常保守。E2结构域中央是决定E2 活性的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基可以识别不同的E3 结构域。在人类基因组E3 大约有600 多种，其在特异性识别底物中最为重要。现已发现鉴定的E3 可分为4 种类型[2]：含有HECT 结构域的E3、 含有RING 结构域的E3、 含有U-box 结构域的E3 和含有PHD 类E3。26S 蛋白酶体是UPP 中降解蛋白质的核心构成，由1 个20S 核心蛋白酶和2 个19S 调节颗粒组成。19S 调节颗粒识别泛素化的靶蛋白使其去泛素化，并将去泛素的靶蛋白转运到20S 核心蛋白酶腔内蛋白水解位点，最终在这些位点上目标蛋白被降解和回收[3]。DUB 是一种从底物蛋白中去除泛素或泛素样分子并分解多泛素链的蛋白酶，在不同的细胞环境中调节UPP 介导的蛋白质降解[4]。

2 泛素化修饰过程

泛素化修饰是由E1、E2 和E3 三种酶协同作用介导泛素分子在底物蛋白上形成泛素链[5]。首先E1水解一分子的ATP 并将一个泛素分子腺苷酰化，E1 活性中心的半胱氨酸残基与泛素的C 端甘氨酸残基形成硫酯键，游离的泛素分子被活化；随后活化的泛素被转移到E2 的半胱氨酸残基上，E2 将泛素转移给泛素-蛋白连接酶E3；E3 直接或间接与底物蛋白结合，促使泛素C 端的羧基与底物蛋白的赖氨酸残基ε 氨基基团上形成异肽键，或者连接有泛素的E2 与E3结合，E2 将泛素转移到蛋白底物上，完成泛素化修饰[6]。泛素化修饰的蛋白可经由26S 蛋白酶体特异性降解，或者改变蛋白质的功能，进而影响细胞内许多重要的生理生化过程[7]。

3 UPP 与离子通道

许多影响中枢神经兴奋性的离子通道蛋白都受UPP 的调节，如钠离子通道（Navs）、钾离子通道（Kvs）等电压门控离子通道，以及AMPA 受体和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体等配体门控离子通道。由于离子通道稳态在调节神经元兴奋性中的重要作用，神经元中UPP 受损可能导致癫痫的发生[8]。

3.1 Nedd4-2 与Navs

在癫痫的遗传学研究中证实，编码电压门控的Navs 蛋白的基因突变是特发性癫痫发生常见的原因。在神经系统中，Nav1 表达的亚型（Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8）通道蛋白的C 端都具有PY 模序，这给泛素E3 连接酶Nedd4-2 提供了一个相互作用的位点。SCN1A 基因编码人类Nav1.1 通道，在大脑皮质及海马表达最为丰富。Escayg 等[9]证实SCN1A 的突变可以破坏与Nedd4-2 的结合，从而阻止了Nedd4-2 对其进行泛素化，导致大脑神经元中Nav1.1 通道功能获得，影响神经元的兴奋性，最终参与癫痫的发生。Nav1.2（SCN2A）和Nav1.3（SCN3A）主要存在于神经元轴突处，Nav1.2 的功能障碍与良性家族性新生儿-婴儿惊厥有密切联系。Rougier 等[10]通过在HEK293 细胞以及非洲爪蟾卵细胞中过表达Nedd4-2，发现Nav1.2 和Nav1.3 的泛素化程度增强，并导致随后质膜上离子通道水平的下调。但突变的SCN2A 与SCN3A 是否影响Nedd4-2 泛素化修饰，目前还不清楚。SCN8A 编码Nav1.6 通道，对中枢和外周神经系统的神经元兴奋性至关重要。O′Brien 研究团队[11]通过构建条件性SCN8A 敲除小鼠模型，发现神经元持续电流和再发电流减少，降低了突变小鼠的神经元兴奋性。Nedd4-2 包含WW1 和WW4 结构域，它们与Nav1.6 的C 端的Pro-Ser-Tyr1945 基序相互作用。Gasser 等[12]共表达Nav1.6 和Nedd4-2，研究发现Nedd4-2 可以显著降低Nav1.6 峰值电流，并且该降低依赖于Nav1.6 的C 端Pro-Ser-Tyr 基序和L1 端的Pro-Gly-Ser-Pro 基序。另外有研究指出，DUB 家族成员中的泛素特异性蛋白酶（USP）增强了Nedd4-2 的磷酸化水平，并且进一步激活了Navs，使癫痫的发生更频繁，神经元的丢失也更明显[13]。

3.2 CRL4A 与Kvs

Kvs 是分布最广、 类型最多的一类离子通道，在真核细胞中主要参与细胞膜静息电位的形成以及动作电位的复极化的调节，因此在神经元和肌肉电兴奋性方面发挥重要作用。Kvs 是由2 个α 亚基和2 个β亚基组成的四聚体，α 亚基组成通道孔，β 亚基维持钾通道正常生理学特性。目前已发现与癫痫相关的Kvs 基因包括KCNA2、KCNC1、KCNT1 以及KCNQ 家族等，Kvs 基因的突变与癫痫的发生存在重要联系。CRL4A 是一种E3，其属于RING 家族一员。CRL4A通过适配器蛋白CRBN 构成E3 泛素连接酶复合体，与Kvs 相互作用，小分子药物沙利度胺，可通过直接与CRBN 结合抑制CRL4A 连接酶底物特异性[14]。Liu等[15]研究表明，E3 连接酶抑制剂处理小鼠癫痫易感性增加，而Kvs 抑制剂处理可以减轻癫痫的发作；CRL4A 可以对Kvs 进行泛素化并将其定位于内质网，利用沙利度胺抑制CRL4A 活性，细胞膜Kvs 蛋白升高，神经元兴奋性增强；DDB1 作为CRL4A 亚基，对其条件性基因敲除的小鼠进行癫痫诱导，与野生型小鼠相比癫痫敏感性增强。该研究提示CRL4A 介导的Kvs 泛素化修饰和CRL4A 活性在癫痫的发生中发挥重要作用。由于Kvs 的功能与癫痫之间存在广泛的相关性，可预测CRL4A 可以成为提高癫痫发作阈值和降低癫痫发作敏感性的靶点[16-18]。Klassen 等[19]通过对特发性癫痫患者的样本进行外显子测序，发现Kvs存在突变，但是这些突变是否会影响CRL4A 介导的Kvs 泛素化，有待进一步的研究。

3.3 Nedd4 家族与谷氨酸门控离子通道

Nedd4 家族是含有HECT 结构域的E3。氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR）是突触后谷氨酸门控离子通道，介导哺乳动物大脑中快速兴奋性神经递质的传递。Nedd4-1 是第一个被证明与AMPAR 的亚基GluA1 在神经元中相互作用并促进泛素化的E3 连接酶。Schwarz 等[20]发现Nedd4-1 过表达使AMPAR 的表达降低。Scudder 等[21]发现过表达缺乏C2 结构域的Nedd4-1，不再引起AMPAR 表达降低。随后Jewett 等[22]发现Nedd4-2 基因敲除可使AMPAR 的亚基GluA1 的泛素化水平下降，神经元活性升高，并证实GluA1 是Nedd4-2 的新底物。Zhu 等[23]通过构建脑组织条件敲除Nedd4-2 小鼠，发现小鼠皮层神经元过度活跃；通过GluA1 亚基泛素化增强海仁酸诱发癫痫的易感性；三种癫痫相关的Nedd4-2 错义突变均破坏了GluA1 的泛素化；降低GluA1 的表达水平能够纠正Nedd4-2 功能不足引起的癫痫易感性。Zhu 等[24]最新研究表明，缺乏C2 结构域的Nedd4-2 对GluA1 泛素化活性降低； 缺乏C2的Nedd4-2 抑制兴奋性突触强度。上述研究表明，Nedd4-1 与Nedd4-2 通过调节AMPAR 的亚基Glu-A1 泛素化，参与癫痫的发生。Kim 等[25]发现吡哆醛-5’-磷酸酶可以在Nedd4-2 的丝氨酸s448 位点去磷酸化，并加速Nedd4-2 的泛素化；在吡哆醛-5’-磷酸酶敲除鼠中，Nedd4-2 表达增加，并通过泛素化Glu-A1，减少GluA1 的细胞膜表面表达以抑制其功能；过表达吡哆醛-5’-磷酸酶后，增加了Nedd4-2 泛素化并促进癫痫发生进展。上述研究表明，吡哆醛-5’-磷酸酶介导的Nedd4-2 的去磷酸化通过GluA1 泛素化调节神经元兴奋性。

NMDA 是存在于中枢神经系统的一类谷氨酸门控性离子通道受体，参与兴奋性突触传递、神经发育、突触可塑性形成等多种中枢神经系统功能。中枢神经系统的兴奋性突触主要以谷氨酸为递质，NMDA 受体表达上调是导致癫痫发作的一个重要因素[26]。当细胞内谷氨酸浓度升高，过度激活NMDA 受体，大量神经元突触后膜发生同步性去极化，神经元产生持续的放电，最终导致癫痫的发作。Gautam 等[27]利用GST-Pull Down 和Co-IP 实验证实，NMDA 受体亚基GluN2D和Nedd4 存在直接相互作用，Nedd4 的WW2 和WW3 结构域与GluN2DC 端PPXY 基序相互结合，增强GluN2D 的泛素化水平并降低了含有GluN2D 亚基的NMDA 受体的反应性。

4 小结

综上所述，UPP 是生物体内蛋白质降解的重要途径，其通过调节神经细胞表面电压门控离子通道蛋白和配体门控离子通道蛋白泛素化水平，进而影响神经元的兴奋性，最终参与癫痫的发生。癫痫发病机制复杂，当前研究主要是来自细胞和癫痫动物模型，可能需要大量的人类标本实验来进一步证实。UPP 参与了癫痫发生发展过程，进一步揭示UPP 更多的靶蛋白，并从各个环节完善具体作用机制，将来为探索以UPP为切入点的癫痫治疗药物提供线索。