PACAP38及其受体PAC1在偏头痛作用中的研究进展

张井艳，吴欣彤，郭 雪综述，陈金波审校

垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide ，PACAP)是一种神经活肽类物质 ，属于血管活性肠肽(VIP )-胰高血糖素-生长激素释放因子-促胰液素超家族。由位于染色体18上的ADCYAP1基因编码，并以两种生物活性形式存在：38个氨基酸形式(PACAP38)和截短的27个氨基酸形式(PACAP27)。在哺乳动物中，最普遍的形式是PACAP38[1]。PACAP38的作用是通过三个G蛋白偶联受体(PAC1，VPAC1-2)介导的。 PACAP及其相关受体广泛分布在中枢神经系统和周围组织中，包括与偏头痛相关的疼痛传递途径的几个区域，例如三叉神经节(TG)和三叉尾神经核(TNC)[2]。关于偏头痛的机制仍有很多待阐明，但最近的注意力集中在信号分子PACAP38上。PACAP38是一种能够在没有先兆的偏头痛患者中诱发偏头痛发作的血管扩张剂。PACAP38对PAC1受体的选择性高亲和力使该受体成为偏头痛治疗的高度有趣且潜在的新靶标。

1 PACAP38和PAC1

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是1989年由Arimura和他的团队从绵羊下丘脑组织中分离出的一种新的神经肽，它能刺激大鼠垂体前叶细胞培养物中腺苷酸环化酶的产生。其主要存在形式PACAP38的N末端序列(1-28)与血管活性肠多肽(VIP)具有近70%的同源性，但PACAP38的腺苷酸环化酶的刺激活性至少是VIP的1000倍。PACAP38在进化过程中一直是保守的，它的氨基酸序列在哺乳动物中都是相同的[3]。PACAP38存在于三叉神经节的一级神经，三叉神经尾核(TNC)的二级神经元和人脊髓的背角。此外，PACAP38还在耳神经节和碟腭神经节，以及大脑皮层，小脑，脑干和下丘脑中被发现[2]。PACAP38的作用是通过三个G蛋白偶联受体(PAC1，VPAC1，VPAC2)介导的，其中两个(VPAC1-2)对PACAP38和VIP具有相同的亲和力，而PAC1受体对PACAP38和VIP的亲和力更高。在三叉神经，耳神经和颈上神经节以及脑膜和脑膜动脉中都记录了所有三种受体的分布[4]。

1.1 PACAP38的药理特征 垂体腺苷酸环化酶激活肽 (PACAP)，是一种神经活肽类物质 ，属于称为血管活性肠肽(VIP )-胰高血糖素-生长激素释放因子-促胰液素超家族。由位于染色体18上的ADCYAP1基因编码。最初表达成为一个前蛋白，然后被加工形成一个38个氨基酸的肽(PACAP38)，该肽具有一个裂解酰胺化位点，可以产生一个27个残基酰胺化的片段(PACAP27)。在哺乳动物中，最普遍的形式是PACAP38[1]。Grände等[5]的研究表明PACAP38舒张颅脑血管的作用在人和大鼠两个物种之间没有显著差异，并且其在大鼠大脑中动脉MCA的远腔面应用可产生强烈的血管舒张反应，而在管腔应用则无效。PACAP38是一个脂溶性较小的大分子，其PACAP38的流入常数(Ki)为2.86 μl/g/min。Banks及其同事[6]首先证明PACAP都可以穿越血脑屏障(BBB)主动转运，它部分可能会被外排泵降解或返回，但其通过血脑屏障的转运量足以影响脑功能。PACAP38通过饱和的转运系统进入大脑的速度却比PACAP27快30%以上且PACAP38对大脑内的降解更具抵抗力。有趣的是，PACAP38的通透性随血液中PACAP38浓度的增加而降低。在小鼠或大鼠中进行的临床前研究一致表明PACAP38通过位于内皮中的蛋白质转运系统6(PTS-6)通过血脑屏障，但PACAP38不能以足够的量穿过内皮以激活动脉壁平滑肌细胞中的受体[7]。PACAP38在血液中的半衰期短，外周给药效果不佳。Nonaka等[8]的研究表明鼻内(i.n.)施用后，放射性标记的PACAP38可以进入大脑，并且他们发现i.n.中包含的三种环糊精中的每一种注射产生I-PACAP在大脑区域之间的独特分布模式。例如，β-环糊精大大增加了枕叶和下丘脑的摄取，α-环糊精增加了嗅球的摄取，而枕叶和纹状体的摄取减少，(2-羟丙基)-β-环糊精增加了丘脑的摄取同时减少纹状体的摄取。这些结果表明，可通过鼻内给药将治疗量的PACAP递送至大脑，并且环糊精可用于将肽治疗性靶向特定大脑区域。

1.2 PACA1的药理特点 PACA 1属于B类GPCR，它在中枢和周围神经系统中高度表达。GPCR的共同基本结构是由三个细胞内和三个细胞外环束缚的七螺旋跨膜结构域(7TM)。B类GPCR具有由120至160个残基组成的N末端胞外域(ECD)，这对于识别肽配体的C末端区域至关重要[9]。与大多数具有相对较小的细胞外N末端结构域的A类GPCR不同，B类受体已经进化出大的ECD，以捕获肽配体以呈现给7TM中的正构受体激活位点。如今较为认可的模型中，肽段的α螺旋C末端区域与B类GPCR的ECD域结合，从而允许将肽段N末端呈递到7TM域内的正构位点，从而引起受体激活[10]。 ECD的开放构象使PACAP结合位点更暴露于细胞外环境，因此更易于用于PACAP结合。在结构上，PAC1R在跨膜结构域中与VPAC1R和VPAC2R共享近60%的序列同一性。PACAP和VIP都以几乎相等的高亲和力与VPAC1R和VPAC2R结合[1]，而 PACAP与PAC1受体具有高亲和力和特异性。Warfvinge K等[2]的研究发现整个大脑，小脑和脑干的许多区域都有PACAP-38和PAC1受体免疫活性的丰富表达。表达模式指向多种功能，包括与疼痛和对疼痛的反应有关，但VPAC1和VPAC2受体免疫活性的表达非常稀疏。

1.3 PACAP38 及其PAC1受体的生理作用 PACAP38是在三叉神经感觉和副交感神经周围血管中发现的一种强血管扩张剂。PACAP38以极高的亲和力与PAC1结合[1]。PAC1受体激活后与Gs双重偶联以刺激腺苷酸环化酶(AC)，而后于Gq双重刺激磷脂酶C(PLC)的激活。 细胞中cAMP的增加可以刺激蛋白激酶A(PKA)/ EPAC途径，这些途径可以相交并增强MEK / ERK信号传导。 PAC1R的激活和β-arrestin的募集还导致受体的内化作用以及用于长期MEK / ERK信号传导的内体信号传导平台的形成[11]。

2 偏头痛

偏头痛是临床常见的原发性头痛，其特征是发作性，多为偏侧，中重度、搏动样头疼，一般持续4～72 h，可伴有恶心、呕吐，光、声刺激或日常活动均可加重头痛。被世界卫生组织列为全球第七大致残性疾病，在世界范围内患病率为11.7%，而在中国则为9.3%[12]。可分为无先兆偏头痛、有先兆偏头痛和慢性偏头痛等。与偏头痛相关的疼痛通常发生在额部，颞部，顶叶，枕部和较高的颈椎区域。世界比较公认的机制其一是[13]：在三叉神经节(TG)中存在丰富的伤害性神经纤维丛，支配着脑膜，蛛网膜和硬脑膜血管，以及大的脑动脉这些颅内结构。这些伤害感受神经纤维的轴突末端包含血管活性神经肽，包括降钙素基因相关肽(CGRP)，P物质(SP)，神经激肽A(NKA)，血管活性肠肽(VIP)和垂体腺苷酸环化酶激活肽( PACAP)。总之，在偏头痛中，含有血管活性神经肽的神经纤维由于被激活从而导致血管活性肠肽的释放，该肽特别能支配颅脑血管，引发偏头痛。

2.1 偏头痛和CGRP 降钙素基因相关肽(CGRP)是血管活性神经肽的一种。在过去的十年中，通过临床研究已牢固确立了CGRP在偏头痛病理生理中的作用。 CGRP的输注可以诱发偏头痛，而CGRP受体拮抗剂可以改善偏头痛。CGRP阻滞是偏头痛患者的新治疗靶标[14]。此外很多类似随机双盲安慰剂对照试验表明CGRP受体拮抗剂能确切的中止急性偏头痛发作[1 5]。目前关于CGRP拮抗剂对偏头痛治疗主要讨论在于其抗体能否通过血脑屏障，及其如何更好的通过血脑屏障。Edvinsson等[16]认为位于BBB之外的三叉神经血管系统在偏头痛症状中具有关键作用，它可能是成功终止偏头痛的新型CGRP药物所针对的。

2.2 PACAP38 及其PAC1受体与CGRP的关系 血管活性神经肽CGRP和PACAP都被认为[17，18]是三叉神经血管系统在刺激后从支配硬脑膜的伤害性纤维中释放出来的，从而导致硬脑膜血管舒张。这两种肽的特征和功能非常相似：例如它们是有效的血管扩张剂，并且可以在伤害感受和神经源性炎症的传递中起作用。Warfvinge等[2]的研究还发现在大脑皮层，三叉神经尾状核，下丘脑和脑桥等多个区域中，Eftekhari等[19]的研究发现PACAP38与CGRP两种神经肽共定位在三叉神经节中。其次CGRP和PACAP都作用于共享一个称为受体活性修饰蛋白1(RAMP1)的辅助亚基的受体[20]。以此推断这两种神经肽可以共享一些生物级联反应，但是PACAP诱导的偏头痛发作也表明了PACAP在偏头痛的发生中具有独立的作用。

3 PACAP38、PAC1受体和偏头痛

3.1 PACAP38 及其PAC1受体在偏头痛动物实验中的研究 目前常用的大鼠炎症汤偏头痛模型主要有弗氏完全佐剂和配方炎症汤两类。在Körtési等[21]的研究中，大鼠口面注射弗氏完全佐剂(CFA)激活三叉神经血管系统(TS)制造偏头痛模型，导致三叉尾核(TNC)中大量CGRP和PACAP38释放。注射CFA后72 h，神经肽的水平达到最大值，并与面部异常性疼痛峰值相对应。Han等[22]通过反复重复炎性汤进行硬脑膜刺激，建立了大鼠慢性偏头痛的大鼠模型。研究表明血浆和三叉神经节中PACAP38水平显着降低，三叉神经节中PAC1受体表达显着增加，而三叉神经尾核中没有，并且VPAC1和VPAC2的表达没有显着差异。Zhang等[23]刺激有意识的大鼠硬脑膜建立了一种新型的重复性电刺激模型，发现电刺激增加了三叉神经节和三叉神经尾核中CGRP，PACAP和PAC1的表达。Hensley等[24]用免疫组化验证了免疫活性物质出现在了大鼠和人类的蝶腭神经节中的神经元细胞体和三叉神经脊束核，而三叉神经节和硬脑膜血管中未检测到染色。而大鼠和人类的原位杂交也显示蝶腭神经节中的神经元和三叉神经脊束核中出现了较强的mRNA信号，在三叉神经核中的信号较弱，在硬脑膜血管中无信号。Syed等[25]的一项离体研究发现PAC1拮抗剂逆转了大鼠MMA中PACAP38诱导的血管舒张。此外，在体内大鼠模型中，在静脉内注射AMG (301PAC1拮抗剂)抑制了三叉神经-颈神经复合体的诱发伤害活性，其结果与舒马普坦所观察到的抑制作用相当[26]。总体而言，动物研究证实PACAP38会诱导血管舒张，同时以上数据也支持了PAC1受体在三叉神经血管系统中的作用，及其PACAP38会诱导血管舒张这些作用很可能是通过激活PAC1受体发挥的。

3.2 PACAP38 及其PAC1受体在偏头痛临床医学中的研究 Birk等[27]进行了PACAP38对人脑血流动力学影响的首次研究，表明PACAP38输注在健康受试者和偏头痛患者中均引起头痛和血管舒张，并且在偏头痛患者中，PACAP38的输注引起延迟的偏头痛样发作。Tuka等[28]用放射免疫测定法研究表明，和健康者相比偏头痛患者血浆的PACAP38样免疫反应物质在发作间期有显著性降低，而在发作期确升高。Zagami等[29]用放射免疫测定法研究也同样表明中度或重度偏头痛患者在头痛发作期间颈外静脉PACAP38升高，而舒马普坦6 mg治疗后1 h开始减少。以上研究表明PACAP38和偏头痛的发作有密切的关系。

Amin等进行的两项人类MR血管造影术研究发现，在健康志愿者[30]和偏头痛患者[31]中，静脉输注PACAP38对大脑中动脉(MCA)的功能没有影响，但对脑膜中动脉(MMA)的持续扩张持续了17%～19%和2 h。有趣的是，体外研究报道了在脑膜和脑动脉中都存在PACAP受体。因此，我们推测MMA的选择性扩张而不是MCA的扩张最有可能是静脉内施用的PACAP38没有穿过血脑屏障。但Amin进一步的研究发现在PACAP38诱发偏头痛发作之前和期间记录了静息状态功能性MRI，发现PACAP38诱导的偏头痛发作与大脑几个大型功能网络的连通性改变有关[32]。

偏头痛发作之前通常会出现药理上可能引起的先兆症状(PS)。Guo等[33]的临床研究表明PACAP38可以诱导偏头痛发作患者产生先兆症状(PS)，在发作患者中占到了48%。但在PACAP38输注后未诱导偏头痛发作的患者中也产生了先兆症状，同时不会在发作患者中诱发更多的PS。这表明PACAP38对先兆症状的诱导并不是诱发偏头痛的必要机制。其次，PACAP在主动穿越BBB后迅速降解或运回[6]，因此，前兆症状有可能通过不受BBB保护的中央结构的激活来介导。

除了持续的血管舒张外，肥大细胞脱粒也被认为是PACAP38偏头痛的诱发机制之一。然而在偏头痛患者中未观察到肥大细胞脱粒的外周血标志物变化[34]。Vollesen等[35]进行了一项双盲随机安慰剂对照的双向转换研究。给予无先兆性偏头痛的患者H1-抗组胺药氯马斯汀静脉输注预处理，随后静脉输注PACAP38，在输注开始后每隔10 min至90 min记录偏头痛/头痛的特征，并收集血液以研究PACAP 38注入前后的肥大细胞脱粒以及炎症标志物类胰蛋白酶和INF-α。结果发现H1-抗组胺药氯马斯汀预处理无法预防PACAP38诱导的偏头痛或头痛，胰蛋白酶和INF-α在PACAP 38注入前后也无显著性变化。因此我们推测在PACAP38诱导的偏头痛中降低组胺释放或肥大细胞脱粒的作用的可能性较小。所以在三叉神经受到刺激后，神经活肽类物质PACAP38释放并发挥舒张血管作用，进而引起硬脑膜和皮层血管的血管舒张，诱发偏头痛的机制仍占主导地位。接下来仍需要我们可以通过进一步的临床和动物实验研究来发现PACAP38扩血管作用参与的分子机制。

4 展 望

偏头痛是世界第七大致残性疾病。最近，在临床试验中，阻断降钙素基因相关肽(CGRP)信号通路的小分子和治疗性抗体减少了偏头痛的发生并中止了偏头痛的急性发作，并为发作性和慢性偏头痛患者提供了预防。异质性存在于每次诊断和患者对治疗的反应中，这表明偏头痛是可能由多种机制激活的最终通用途径，例如，并非所有偏头痛发作都对抗CGRP药理学干预有反应或被预防。因此，偏头痛发病机制的其他独特机制可能会为药物开发提出新的目标。

垂体腺苷酸环化酶激活肽38(PACAP38)是一种神经活肽类物质，引起了大家的广泛关注，是治疗偏头痛的有吸引力的新型靶标。在这里，我们回顾了PACAP38在偏头痛的病理生理中的作用，以及涉及PAC1受体作为偏头痛未来药物靶点的数据。Loomis等[36]生成了对PACAP38和PACAP27都具有反应的特异性、高亲和力、中和性的单克隆抗体ALD1910。在体外，ALD1910通过VPAC1和VPAC2受体以及PAC 1受体有效拮抗PACAP38信号传导。ALD1910识别PACAP内的一个非线性表位并阻断其与细胞表面的结合。为了测试针对内源性PACAP38的ALD1910拮抗特性，我们开发了伞形酮诱导的大鼠神经源性血管舒张和副交感性流泪模型。在体内，该模型证明ALD1910的拮抗活性是剂量依赖性的，在低至0.3 mg/kg的剂量下仍保持效力。这些结果表明ALD1910代表潜在的治疗性抗体，以解决PACAP38介导的偏头痛。

尽管动物实验和临床实验研究都表明PACAP38的输注可以诱发偏头痛，但目前尚无确凿证据表明，PACAP38的外源性输注后，其会通过BBB然后导致脑功能和脑血管改变直接来诱发偏头痛。因此，PACAP38偏头痛的诱导作用可能是由周围机制引起的，有一种可能性是通过诱发脑膜变化或影响颅脑血管中缺乏BBB的伤害感受器引起的。 所以迫切需要未来先进的体内人类研究和使用放射性标记示踪剂探索PAC1受体抗体，以阐明PACAP如何以及在何处导致偏头痛的发展。

在这里，我们回顾了垂体腺苷酸环化酶激活肽38(PACAP38)在偏头痛的病理生理、药理中的作用，以及涉及PAC1受体作为偏头痛未来药物靶点的数据。 关于偏头痛的病理生理学还有很多尚待充分阐明， PACAP38对PAC1受体的选择性亲和力使该受体成为偏头痛治疗的高度有趣且潜在的新靶标。 该受体拮抗作用的有效性应在随机临床试验中有很大的研究意义，并有望和CGRP一样成为治疗偏头痛的重要靶标。