与NF-κB相关的长非编码RNA-NKILA 在神经系统疾病中的研究进展

胡雪纯, 程 颖, 屈阳柳综述， 贾 妮审校

长非编码RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)具有重要的生物学功能，可在多个层面调控基因表达，是神经系统疾病病理过程的重要解密分子。在神经系统疾病中，NF-κB的激活与细胞凋亡和神经元活化关系密切。2015年新发现了一种LncRNA-NKILA能有效防止NF-κB通路的过度激活，因此NKILA可能是神经系统疾病病理过程中重要的机制调节分子。通过检索近年来国内外发表的所有NKILA相关的文献，下文将对NKILA在神经系统疾病中的研究进展进行如下综述。

1 长非编码RNA-LncRNAs

1.1 构成单位 在人类基因组中，约2%的基因组序列在经历转录、再翻译环节后，合成蛋白质发挥其生物学效应；而其余98%的基因，因其转录为RNA后不具有“编码蛋白质”的功能，而被称为非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)[1,2]。其中，有一类ncRNAs因其长度较长(>200 bp)，而定义为长非编码RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)[3]。

1.2 作用机制 LncRNAs属基因组学领域，其主要位于细胞核内，大多具有着poly-A尾巴和5’端加帽的mRNA样结构，由RNA聚合酶Ⅱ转录后，不经过翻译，而在直接经历剪接、5’端加帽、3’端多聚腺苷酸化等共修饰和RNA折叠过程[4]，形成二级空间结构后才能发挥其生物学作用。LncRNAs可以在不同水平阶段调节DNA、RNA及蛋白质：(1)转录前阶段：改变DNA和组蛋白表观，影响下游转录；(2)转录阶段：影响RNA聚合酶活性，调节转录因子表达[5]；(3)转录后阶段：在翻译过程中，通过“磷酸化、泛素化等”过程，影响蛋白质活性[6]。总言之，LncRNAs可以起到信号子、诱导子、结构支架等作用[7]。

1.3 功能定位 对LncRNAs的功能认识在经历不断深化研究后，目前认为：种类繁多、数目庞大的LncRNAs不仅调控人体的生理过程，还几乎参与了所有病理状态的调控。在LncRNAs与疾病关系的研究方向中，概括其研究领域大致可分为：(1)各种癌症的诊断及治疗靶点：LncRNAs的异常表达会引发多种疾病，其中主要与肿瘤的发生密切相关[8]，目前众多研究证实LncRNAs参与调控非小细胞肺癌[9]、肝癌[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、甲状腺癌[13]等的增殖、侵袭、转移过程；(2)神经系统疾病的诊断及治疗靶点：有研究表明，约有40%的LncRNAs在大脑中表达，参与人类大脑的神经发育过程[14]。LncRNAs的表达失调会导致神经系统的病理现象，目前已有LncRNAs与脑缺血[15]、颅脑损伤[16]和原发性脑瘤[17]等,但其中LncRNAs发挥的作用机制还尚未研究清楚。因此，现阶段对LncRNAs在正常生理水平和病理状态下的信号通路机制的研究成为了热点，希望能为疾病的发生发展和治疗提供新的思路和潜在靶点。

2 核因子κB-NF-κB

2.1 构成单位 核因子κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)是Sen和Baltimore[18]于1986年首次在B细胞中提取出来的核蛋白因子，几乎存在于所有的动物细胞中[19]。NF-κB蛋白家族有5个基本组成单位(又称诱导型转录因子)：RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50、p52[20]，其中，前3个亚单位可组成一组亚基，后两个成员P50和P52组成另一组亚基，这两组亚基通过相同或搭配组合，形成同源或异源二聚体[21]，此时经过二聚化后的NF-κB才被激活发挥生物学效应。此外，在NF-κB信号通路中，有两个蛋白-IκB与IKK发挥着重要的调节作用。IκB(inhibitor of NF-κB)是NF-κB信号通路的抑制物，该蛋白可与处于未被激活状态下的NF-κB结合形成非活性的胞质复合体；而IKK(IκB kinase)是IκB激酶，当经历细胞内、外刺激后，IKK会被激活，此时IκB将发生磷酸化并出现化学结构的改变[22]。

2.2 作用机制 在正常生理状态下，NF-κB蛋白处于静息态在细胞质中，并与IκB-α结合，组成一个无活性的复合物[23]。而当受到各种刺激时，IκB激酶(IKK)被激活，IκB-α被磷酸化后再被泛素化降解；此时，胞质内NF-κB被解聚脱落，IκB-α发挥的“抑制NF-κB激活”的效应消失，NF-κB被激活[22]；随之，解绑脱离下来的NF-κB转入细胞核，与多种靶基因的启动子或增强子区的NF-κB结合位点特异性结合[21]，调控靶基因的转录表达[24]。然而，NF-κB的激活并不是单方向的、持续的。当NF-κB完成其促进转录的任务后，会出现一个负反馈机制，即NF-κB反向激活、表达IκBα，从而二者重新靶向结合成无活性复合体[25]。由此可见，精细调控NF-κB信号通路仍具有着复杂性与未知性。

2.3 功能定位 NF-κB是细胞内最重要的转录因子家族，在炎症、免疫、细胞增殖、分化和生存中发挥着关键作用。在神经系统中，NF-κB广泛分布在神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞中[26]。在神经系统疾病的病理学相关研究中，我们发现NF-κB对神经细胞的影响具有双面性：(1)当NF-κB被短暂激活时，能诱导BCL-2、BCL-XL、BIRC5等神经元保护因子的转录[27]，这类抗细胞凋亡基因的表达，能发挥神经元保护作用；(2)但如果NF-κB被广泛的、持续的激活表达后，也能产生iNOS、COX-2等[27]，这类促细胞凋亡基因的表达，会导致神经元死亡等病理状态。因此，在对疾病的治疗机制探索中，把握NF-κB的适度激活具有重大意义，有待进一步研究。

3 LncRNA-NKILA

3.1 NKILA的生理概况 2015年，Liu等[28]人在研究乳腺癌时首次鉴别出了一个LncRNA家族的新成员，这个新发现的LncRNA由染色体20q13基因编码[29]，长度为2570 nt，能参与调控NF-κB信号通路，因此在对其命名中涵盖了与NF-κB的相互作用关系：NF-KappaB Interacting LncRNA，简称为NKILA。在对NKILA的基础研究中发现：在NKILA的转录起始点(TSS)上游的104-95位置上[30]，存在一个与NF-κB结合的特异性位点。在生理状态下，NKILA通过两种作用方式：(1)NKILA直接隐蔽IKK酶的磷酸化位点从而抑制IκB磷酸化作用[31]；(2)NKILA结合在NF-κB家族诱导型转录因子之一RelA(p65)的两个位点上，稳定的结合在NF-κB/IκB复合物上[32]，从而使NF-κB信号通路处于静息未被激活的状态。简言之，这个新发现的LncRNA-NKILA是NF-κB信号通路的负性调节因子，它能有效防止NF-κB通路的过度激活。因此，新的研究热点开始集中于探究：在各类疾病中，NKILA的表达有什么变化；在病理状态下，调节NKILA的表达量能否通过NF-κB信号通路的机制链发挥疾病治疗作用。

3.2 NKILA的研究热点 检索自NKILA发现以来的5 y里国内外所有研究文献，发现对NKILA的病理学研究主要集中在癌症疾病中。如在对乳腺癌患者NKILA表达情况的研究中，发现：与健康人对照组相比，乳腺癌患者的癌细胞内NKILA的表达出现下调[33]；而通过转染NKILA过表达载体以后，(1)NKILA的过表达会诱导癌细胞的凋亡率上升，而抑制癌细胞的增殖、迁移；(2)NKILA过表达会显著抑制IκBα的磷酸化水平和P65的核转位，抑制NF-κB信号通路的激活；(3)NKILA的过表达通过NF-κB信号途径显著抑制IL-6和VEGFA mRNA的表达。探究NKILA影响血管生成后对肿瘤的治疗作用机制：在癌症中，与肿瘤相关的血管生成将为肿瘤的生长、侵袭和转移提供血供养分[34，35]，使预后恶化，而NF-κB、白介素6(IL-6)和血管内皮生长因子(VEGFA)的表达与血管生成密切相关[36]。因此，干预NKILA的过表达从而抑制NF-κB/IL-6/VEGFA信号，会使乳腺癌的血管生成减少，会遏制住乳腺癌的恶性进展。再比如大肠癌NKILA表达的研究[37]：在大肠癌患者的癌组织、癌细胞中均发现了NKILA表达的下调；并且NKILA病理状态下的低表达使NF-κB的过度激活，从而与肿瘤体积大、恶性度高、出现淋巴结转移、疾病预后差关系密切。此外，相同的病理表达情况在食管鳞状细胞癌[38]、非小细胞肺癌[39]、鼻咽癌[40]、肝癌[30]、直肠癌[41]、舌鳞状细胞癌[42]等研究中也得到了相同结论的印证：NKILA在癌细胞内的表达明显降低，且NKILA的低表达与不良生存结局相关。NF-κB的异常激活是许多癌症发生的基础，若使NKILA过度表达，即能通过抑制NF-κB的过度激活抑制癌细胞的运动行为，降低了其向体内外的增殖、转移、侵袭能力。因此，NLILA不仅有望作为癌症的潜在诊断和预后标志物，也可被视为是一种抑癌LncRNA，通过阻断NF-κB信号抑制癌症的病情进展，成为治疗的关键调节靶点。

3.3 NKILA的调节因子 众所周知，LncRNA含有小分子RNA(microRNAs，miRNAs)的结合位点，miRNAs通过去烯基化途径能够降解LncRNA的PolyA尾巴[43]。正如研究发现：在NKILA的1203-1234 nt上，存在着miR-103和miR-107的特异性结合靶点；当NKILA与miR-103/107特异性结合后，NKILA会被迅速降解[28]；随之，将会出现NF-κB信号通路的激活。在肿瘤细胞中，miR-103/107的水平显著异常上调，此时NKILA会被高表达的miR-103/107大批量降解[44]，从而异常激活高表达的NF-κB会导致癌细胞的体外增殖、侵袭、转移，疾病预后不良。反之，如果使用miR-103/107的反义寡核苷酸使NKILA不被降解，则NKILA仍能发挥对NF-κB信号通路的抑制作用，能抑制癌细胞的运动行为，降低不良预后。

4 NKILA与神经系统疾病

对比其他系统，LncRNAs优先富集分布于神经系统中，目前已知约40%的LncRNAs在大脑中表达，LncRNAs参与着大脑的复杂性调节过程[45]。LncRNAs不仅参与人类大脑的进化神经发育过程，也参与脑组织的多种生理病理过程[46]，LncRNAs是神经系统中不可忽视的调节型RNA。近年来的研究显示：在老年人和神经系统疾病患者中，LncRNAs会出现异常表达，因此研究人员都在推测：LncRNAs是神经系统疾病病理过程的重要解密分子，LncRNAs有望成为神经系统疾病诊断和治疗的新靶标[47]。其中，2015年才首次发现的LncRNA-NKILA在神经细胞中的表达和潜在功能才刚开始研究。检索国内外相关文献数据库，迄今为止找到了数十篇相关的实验室观察及临床研究，下文将对其进行详细分述。

4.1 NKILA与缺血性脑卒中 目前，全世界严重的人口老龄化问题使卒中的发病率和死亡率不断攀升。作为全球第2大死亡原因，卒中在我国却是全因死亡的首要疾病[48]，其中缺血性脑卒中占69.6%～70.8%[49]，因此，开发新的治疗方法以应对卒中疾病迫在眉睫。在卒中的治疗环节中，本以为快速恢复脑缺血半暗带的血液供应，会使濒死的神经元细胞还有望存活，然而现实却可能会面临血液再灌注后神经元更严重的损伤[50]，对此病理现象的机制解释，目前仍未完全明确，但也总结出了以下方面：诱导炎症级联反应不断扩大、氧化应激、代谢毒素积累、酸中毒、细胞凋亡等[51]，对其机制的研究仍亟待广泛深入挖掘。

Mei W[52]等人在NKILA与缺血性脑卒中关系的研究中发现：对神经细胞进行氧葡萄糖剥夺/再氧合(OGD/OGDR)的缺血再灌注模型后，NKILA表达显著上调，NF-κB的靶基因Bfl1/A1和Bcl-XL蛋白的表达水平显著受抑制，神经细胞的活力下降，促凋亡蛋白caspase-3激活，诱导了神经元的凋亡坏死。分析此实验结果：NKILA的高表达使其隐蔽IKK酶磷酸化位点以及结合NF-κB/IκB复合物的能力明显上升，通过抑制NF-κB的激活，减少NF-κB过度活化对神经细胞存活造成的进一步损害[53]。该实验还通过调节NKILA的表达以进一步观察脑缺血再灌注与NKILA、NF-κB的关系，发现：当shRNA介导NKILA沉默(NKILA shRNA)时，OGDR诱导的NF-κB抑制状态几乎被完全逆转，NF-κB被激活，同时作用下游凋亡级联通路的蛋白激酶caspase-3的表达下调，能抑制神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用；反之，在转染慢病毒载体使NKILA过度表达时，NF-κB被显著抑制，神经细胞进一步凋亡、坏死，神经细胞活力显著降低，再灌注损伤更严重[52]。这提示我们：NKILA不仅有望成为缺血性脑损伤新的诊断靶标，在缺血性脑损伤病程中，也有望通过沉默NKILA的表达来抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用，成为应对脑缺血再灌注损伤的新治疗靶点。此外，还有研究发现：脑缺血再灌注会诱导神经元细胞的miR-103/107表达下调[52]，则其降解NKILA的作用减弱，从而出现NKILA的表达增加，神经元的凋亡。因此，应用miR-103/107模拟物转染技术上调其表达，可能会通过miR-103/107→NKILA这一调控通路环节发挥抑制神经细胞的死亡、促进神经细胞的生长发育的作用，这有待我们进一步深入研究。

4.2 NKILA与脑出血 脑出血是一类死亡率、致残率极高的疾病。在急性期时，出血部位血肿直接压迫脑组织，炎性因子被激活，出现颅内压增高及相应功能区的神经功能缺损症状[54]；目前对急性期的治疗主要以降颅压、控制血压、手术等对症治疗为主。继而，脑出血后脑组织继发的炎症损伤、小胶质细胞的激活、炎性因子的表达，对脑组织的伤害也尤为重要，导致脑内细胞缺血缺氧性坏死凋亡。长非编码RNA(LncRNAs)是一类与脑功能和神经系统疾病相关的分子，近年来多个研究报道了脑出血后脑组织中LncRNAs的表达有差异[54]。其中，Jia JY等人[55]在动物实验中发现：与正常组与假手术组大鼠相比，脑出血(ICH)组大鼠NKILA表达呈低表达，而神经元蛋白中IκBα、p-IκBα、P65、p-P65表达增加，NF-κB信号通路处于激活状态。当腹腔注射抑制NKILA表达的小干扰因子(siRNA)后，ICH+siNKILA组大鼠的NKILA表达更低，IκBα、p-IκBα、P65和p-P65的表达增加更明显，神经功能缺损评分、血肿体积、脑水肿程度、神经元肿胀程度更差，炎性细胞浸润程度、细胞凋亡、神经元变性坏死更严重。反言之：NKILA能通过抑制NF-κB的活化程度而控制脑出血的不良进展。有研究表明，NF-κB的激活在脑出血后炎症反应中起着重要作用，是脑出血后6个月不良预后的独立预测因子[56]。因此，干预NKILA过表达可能会通过抑制NF-κB的过度激活，控制脑出血后的炎症级联反应，NKILA有望成为治疗脑缺血的重要调节靶点。

4.3 NKILA与癫痫 癫痫是常见的神经系统疾病之一，目前不论是癫痫动物模型实验还是癫痫患者临床观察试验，均早已证实LncRNAs参与了癫痫的发病机制[57,58]。癫痫的病理过程往往伴随着数百个LncRNAs的表达波动。在2020年发表的一项临床观察中，Mirzajani[59]等人使用QRT-PCR法对80例癫痫患者(40例难治性、40例非难治性)和40例正常人的外周血进行LncRNAs表达检测时，发现：癫痫难治组、癫痫非难治组的NKILA表达水平均高于健康对照组，但难治组和非难治组之间的表达水平没有差异，即：癫痫患者的LncRNA-NKILA表达普遍升高。同样的，目前在癫痫动物模型及临床观察实验中均证实了核转录因子NF-κB参与了癫痫的发病机制。如在一项动物实验中发现：癫痫动物模型中，海马CA1区、CA3区、神经元细胞中均有NF-κB被激活高表达的情况，并伴随着iNOS的高表达，最终导致海马神经元死亡。如韦倩娜[60]等人的临床观察中发现：癫痫患者脑组织及外周血中炎性细胞因子(如IL-1β、TNF-α、COX-2等)显著增高，进一步激活NF-κB信号通路。即：NF-κB活化介导的炎症反应过程可能是癫痫发病机制中的重要环节。

综上所述，癫痫患者NKILA的高表达可能是由于NF-κB过度激活诱导的，而高表达的NKILA能遮挡IκB的磷酸化位点，从而抑制NF-κB通路的继续激活，起到对癫痫病理机制的调节作用。因此，在以后癫痫疾病的研究中，可对NKILA进行更加深入的调节机制探索。

5 结语与展望

综上所述，LncRNAs作为基因组学领域的新发热点，近些年来得到了快速的发展。其中，新发现的LncRNA-NKILA参与了众多疾病的病理过程，尤其在肿瘤相关领域。而在神经系统疾病中，目前仅观察到NKILA参与缺血性脑卒中、脑出血、癫痫的病理过程，且无论细胞处于静息状态还是炎症激活状态，NKILA均能有效防止NF-κB通路的过度激活，从而参与细胞的凋亡和神经元的活化。因此，未来深入探索神经系统疾病中NKILA的表达和病理作用机制具有着光明的研究前景，NKILA不仅有望成为神经系统疾病的诊断生物标记物，也会为发病机制的研究提供新的思路方向。