血流感染的实验室分子诊断研究进展

陈明慧，陈莎燕，房 杰，孙兰菊，常艳敏

血流感染（bloodstream infection，BSI）是病原微生物侵入血液循环而引起的严重的全身感染性疾病[1]，具有起病急骤、病死率高的特点。近年来,随着静脉置管等侵入性操作和广谱抗生素及免疫抑制剂等药物的广泛应用，血流感染的发生率和严重程度逐年升高。在世界范围内，血流感染是北美和欧洲排名前七的死亡原因[2]，其公共卫生问题日益严重。血流感染死亡率的上升往往与抗感染治疗的延迟，不足或不适当有关，在抗生素治疗中，感染性休克后每延迟6 h，生存率就会降低7%以上[3]。

目前，血培养被认为是诊断血流感染的参考标准，并且仍然是必不可少的。在取够足量的标本（即至少两到三套血培养瓶，每瓶装满10 mL）的情况下，血培养的灵敏度可达95%以上，且操作方便，亦可良好地显示培养病原体对抗菌药物的敏感性。但是，血培养也具有一些缺点，如检测周期长，无法识别细菌或酵母菌以外的生长缓慢或专性的细胞内微生物和病原体，以及以前曾接受过抗菌药物治疗的患者，其血流感染相关的微生物检测可能大幅延迟或甚至无法检测到。这些缺点可能导致重要的后果：首先，尽早地对血流感染开始适当的抗生素治疗，尤其在临床诊断后的第1 小时内，对降低发病率和死亡率至关重要；其次，由于以培养为基础的诊断很慢，医生经常不得不开始凭经验使用广谱抗菌治疗；此外，较长的培养时间也导致确切的临床诊断延迟，住院时间增加，并发症发生率提高，从而最终增加医疗费用。因此，临床迫切需要快速检测和鉴定病原体，从而优化抗菌治疗的疗效，降低初始治疗附带的损害，例如毒性，副作用和抗菌药物耐药性的产生。

因此，十多年来用于早期识别病原体和一些耐药因子的病原体特异性检测已经被测试和开发出来。这些分子工具已被测试作为血培养的替代或补充[4]。根据阳性血培养的革兰染色结果，微生物实验室可以决定使用哪种特定分子方法以满足他们的需求。本综述介绍了诊断血流感染的分子方法的最新进展。

1 从阳性血培养物鉴定病原菌的分子方法

1.1 基于原位杂交的方法 杂交测定是两条互补核酸链的特异性结合，其中一条探针是已知特性的核酸序列，另一条靶序列是待鉴定的未知微生物的基因组的一部分，荧光原位杂交（FISH）测定即基于该原理。在FISH 中，荧光标记的寡核苷酸探针用于特异性结合靶病原体基因组中的核糖体DNA（rDNA）区域，即细菌的16S rDNA 基因或真菌的18S rDNA 基因，通过荧光显微镜观察探针和互补序列之间的这种特异性结合。虽然FISH 技术可以识别血液中最常见的细菌和酵母，但由于检测中可用的物种特异性探针数量有限，因此不能鉴定所有致病菌[5]。

第一个商业化的基于FISH 的技术是PNA-FISH，使用肽核酸探针（PNA）可检测金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌，屎肠球菌，大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌和念珠菌等临床常见的血流感染病原菌。PNA-FISH 可在2.5 h 内提供结果，并于2013 年推出更快，更节约劳动力的版本Quick FISH，提供结果仅需不到30 min[6]。但PNA-FISH的缺点为病原菌数量的检测限（LOD）需达到105CFU/mL，PNA-FISH 探针数量有限，以及缺乏所鉴定微生物的抗菌药物敏感性[7]。PNA-FISH 和Quick FISH 的敏感性和特异性分别为97%～100%和90%～100%。

Accu Probe 系统也是基于DNA 探针的杂交。Gen-Probe 商业化测试可鉴定金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，肠球菌属及A 群和B 群链球菌。起初开发这些测试用于鉴定培养物中的病原体; 然而，Lindholm 及其同事修改了制造商的标本制备说明，可使用直接用阳性血培养物制成的细菌颗粒。对于大多数病原体的检测，灵敏度和特异性显示高于97.9%，测试时间为1 h[8]。

1.2 基于DNA 微阵列的杂交技术 DNA 微阵列由固定在固体表面上的短寡核苷酸组成，它们可同时并行检测许多病原体及其抗菌药物的耐药基因。DNA 微阵列覆盖的物种一般约为已知引起血流感染的所有病原体的90%～95%，灵敏度范围为101～105CFU/ mL[9]。Verigene 系统是美国食品和药物管理局（FDA）批准的基于DNA 微阵列的检测系统，该系统可鉴定12 种革兰氏阳性细菌以及相关的耐药基因（vanA，vanB，mecA），和9 种革兰氏阴性菌及它们的耐药基因（bla VIM，bla NDM，bla OXA，bla KPC和bla CTX-M）。该系统可以直接从阳性血培养物中识别细菌种类以及相关的耐药基因，灵敏度为81%～100%，特异性高于98%[10]，测试时间为2.5 h。日本的一项研究表明，在由Verigene 试验靶向的单一病原体引起的菌血症中，Verigene 试验与血培养之间的细菌鉴定一致性很高，革兰阳性菌和革兰阴性菌分别达97.4%和100%[11]。然而，如果血培养中病原菌并非单一菌种，出现混合菌生长，Verigene 系统则无法检测到耐药基因与特定病原体的关联[12]。

1.3 基于核酸扩增的方法 最常用的核酸扩增技术是聚合酶链式反应（PCR），用于直接从血液以及阳性血培养物中鉴定病原体。诊断实验室中使用的PCR 测试基于广谱PCR或多重PCR。广谱PCR 使用针对细菌（16S）或真菌（18S）基因组的保守rDNA 区域的通用引物，随后通过测序或属/种特异性实时PCR 测定鉴定微生物。常见的有FilmArray系统和Xpert MRSA/ SA 系统。

Film Array 是一个自动化多重PCR 平台，它结合了样品制备，PCR 扩增，检测和分析。Film Array 血液培养鉴定小组（BCID）可以在1 h 内识别来自阳性血培养物的19 种细菌和5 种念珠菌以及4 种耐药基因（vanA，vanB，mecA，bla KPC），实际操作时间仅需2 min。在一项随机对照试验中，所有微生物靶标的敏感性均超过96%，特异性为99%。耐药基因vanA/B，bla KPC 的鉴定敏感性和特异性达100%。但是，可产生对金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中mecA 基因检测的假阳性结果[13]。

Xpert MRSA/SA 检测基于实时PCR，可在约1 h 内鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。该试验通过检测葡萄球菌蛋白A（spa）基因，耐甲氧西林（mecA）基因以及携带mecA基因的葡萄球菌染色体盒（SCCmec）和金黄色葡萄球菌基因组（orfX）之间的连接序列，进一步分析鉴定是否为MRSA。据报道，对于金黄色葡萄球菌，鉴定的敏感性和特异性分别为99.6%和99.5%，MRSA 分别为98.1%和99.6%[14]。

1.4 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS） 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）彻底改变了细菌鉴定方法，这种方法广泛应用于临床微生物实验室。其原理是将基质和样品混合点在金属靶盘上形成共结晶薄膜，基质分子吸收激光的能量使样品吸附，并使其发生软电离，形成不同质荷比(m/z)的带电离子。在电场作用下，样品离子通过高真空的飞行时间管到达检测器，质荷比越小，时间越短；根据到达检测器的飞行时间不同，以质荷比为横坐标，检测到的离子峰强度为纵坐标，进行质量分析，形成质量图谱，通过软件分析比较，筛选并确定出特异性图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的鉴定[15]。MALDI-TOF MS 能够识别多种微生物，快速获得结果，具有较高的准确性和可重复性且满足成本效益。市场上有两种主要的商业系统：法国梅里埃Vitek MS 和德国布鲁克Microflex LT Biotyper 质谱检测系统。

MALDI-TOF MS 对革兰氏阴性菌如肠杆菌科细菌，非发酵菌等鉴定准确率高，与VITEK-2 的鉴定符合率达95.83%[16]；对厌氧菌[17]和结核分枝杆菌[18]的分析和鉴定较传统方法有明显优势；MALDI-TOF MS 还可检测微生物的耐药性，主要方法有直接分析法，酶水解法和曲线下面积计算法等[19-21]。然而，MALDI-TOF MS 在微生物鉴定和药敏中依然存在一定的局限性，如MALDI-TOF MS的质谱数据库还需完善，对某些病原菌的亚种及少见菌鉴定会存在误差，目前临床使用的商品化数据库主要来自梅里埃和布鲁克两大厂家，且多为国际菌株，难以满足本土化的微生物鉴定需求；虽然目前已有许多关于细菌耐药检测方面的研究，但是尚处于起步阶段，距离应用于临床还需很多工作；国内实验室该技术应用尚处于初级阶段，各临床实验室的操作习惯不同可能会直接影响数据的准确性和重复性，因此MALDI-TOF MS 的操作标准化问题也亟待解决。

2 直接从血液中鉴定病原菌的分子方法

直接在全血样品上进行的分子方法可以节省孵育的时间，避免在识别生长缓慢的细菌或无法培养的微生物时，以及在患者已经接受抗菌药物的情况下对血培养的限制。此外，与血培养相比，对于难以获得更大量血液的儿科患者，仅需较少量的血液样本使得这些分子方法更具优势[22]。然而，为检测微生物而开发的分子方法主要基于PCR 的分析，患者血液中存在大量人类DNA 以及其他血液成分，会干扰并抑制PCR 反应。尽管PCR 测定通常非常敏感，但污染DNA 或来自死亡微生物的DNA，可能导致产生假阳性结果。在这里，我们将对常用的分子方法进行阐述。

2.1 基于核酸扩增的方法 罗氏Septi Fast 是采用多重实时PCR 技术。该试验能够在约6 h 内直接从1.5 mL 全血中鉴定最常见的血流感染病原体，包括19 种细菌和6 种真菌。在一项诊断儿童发热性中性粒细胞减少症的研究中，显示Septi Fast 试验的敏感性和特异性分别为91%和98.3%[23]。因此，基于PCR 的检测可用于采血困难的儿童，可弥补血培养需采集大量血液的缺陷。

Sepsi Test 系统是经CE 认证的检测方法，结合了广谱PCR 和测序技术。该测试使用针对细菌16SrDNA 和真菌18S rDNA 区域的通用引物进行广谱PCR，然后对来自阳性样品的扩增产物进行测序，随后进行BLAST 分析以鉴定属和物种水平的病原体。该检测可处理低至1 mL 的血液量，所需时间为8～12 h。一项研究报告显示，Sepsi Test系统的特异性和敏感性分别为86%和48%[24]。

2.2 基于T2 磁共振的方法

T2 磁共振是一种基于磁共振的诊断方法，可测量存在磁场时水质子T2 张弛信号的变化。其方法为病原体特异性PCR 扩增，然后将扩增子与富含探针的超顺磁性纳米颗粒杂交。一项近期的研究[25]表明，T2 磁共振诊断可用于检测细菌和念珠菌引起的血流感染，在检测到的细菌血培养阳性患者中，敏感性和特异性分别为89%和98%。

2.3 宏基因组学方法 宏基因组学是对被检测样品中存在的特定或所有遗传物质的基因组进行分析，样品中核酸的测序可以基于特定扩增子或整个基因组（鸟枪宏基因组学）。基于特定扩增子的方法虽已证明可直接从血液中诊断细菌，但目前为止还没有开发出商业上可获得的方法。鸟枪宏基因组学具有不受某些病原体限制的优点，并且提供样品中存在的所有微生物和病毒的信息[26]。此外，鸟枪宏基因组学可以检测抗菌素耐药性和毒力基因，并提供有关分子流行病学的重要信息。到目前为止，猎枪宏基因组学仅适用于血液或血液成分，并且只开发了一种商用工具，临床实验室的引入可能会受到高成本，分批测试方法和测序所需的复杂的基础设施的限制。

综上所述，血流感染的实验室分子诊断技术能够快速、准确地对血流感染病原体进行鉴定，弥补传统血培养的固有缺陷，但其一些技术方法尤其是药敏分析尚需完善，且具有高昂的成本，无法完全替代血培养。因此，血流感染的诊断可联合多种新型分子诊断技术和传统方法，从而提高血流感染诊断的时效性和准确性，为血流感染患者的早期诊断和合理用药提供重要参考。