肝细胞癌的基因组学和基因靶向治疗的研究进展

王文晶 曹国洪

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一。近年来对HCC基因组学的研究已取得一定进展，本文总结了HCC病因相关基因、HCC特异血清指标甲胎蛋白（AFP）相关基因、HCC转移相关基因等研究成果。另外通过构建HCC特异基因模型，寻找HCC治疗的新靶点新方法。本文就此作出如下综述。

1 HCC发生、发展的基因组学

1.1 HCC病因相关基因研究 目前已知HCC的发生与病毒感染、致癌物污染以及遗传因素有关。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染在我国HCC病因中占主导地位，其次为强致癌剂黄曲霉素 B1（aflatoxin b1,AFB1），另外一些HCC患者具有家族聚集性和遗传易感性。总之，HCC的发生涉及多因素多步骤的癌变过程。早前研究发现HBV的DNA可整合入人体HCC细胞的DNA中，经检测发现HCC组织中HBV-DNA的整合率远高于正常肝组织，且此现象具有高度易变性和随机性[1]。通过对81例HBV阳性HCC患者行全基因组测序，研究者发现HBV阳性者癌组织86.4%有HBV-DNA的整合，而癌旁组织仅有30.7%；同时发现在整合位点区域有较多基因拷贝数目变异，其中最主要的3个为端粒酶逆转录酶（TERT）、mixed-lineage leukemia（MLL4）gene、细胞周期蛋白 E1 基因（CCNE1）[2]。HBVDNA的整合可引起基因组置换、缺失和反向复制等改变，进而影响细胞周期、分化和凋亡等功能，因此学者发现动态监测HBV-DNA含量变化具有一定意义。如肝动脉栓塞介入治疗（TACE）可影响HBV-DNA含量的变化，一些学者对TACE治疗前后HBV-DNA含量的变化进行研究，认为TACE治疗可引起HBV-DNA的再活化[3]。同样致病条件，不同人群所致结果不同，因此HCC的发生与个体间基因遗传多态性有关，即易感基因。经统计HCC发生的性别差异在HBV病例中最为明显，男性更易发展为HCC。男性HCC发病率为3.7～31.9/10万例/年，女性为1.4～10.2/10万例/年[4]。HBV携带者中，较高的雄激素通路活性与男性HCC高发病率相关。研究发现雄激素受体通过整合HBV在TERT启动子区的点突变来增强TERT效应，被认为是HBV相关HCC男性高发病率的机制，因此雄激素受体可能成为HCC治疗的靶点[5]。

p53是一种肿瘤抑制基因，正常p53为野生型，可监护细胞基因的完整性；p53突变体不仅丧失抑癌活性，反而具恶性转化功能。HCC强致癌剂AFB1属二氢呋喃杂萘的衍生物，研究发现AFB1可使部分p53发生突变生成p53-R249S，即p53第249位密码子精氨酸（AGG）置换为丝氨酸（AGT）。在含p53突变的HCC中，p53-R249S发生率约为30%，且在HCC高危区的发生率超过96%[6]。另有研究提示HBV编码的x蛋白(HBx)可能具有促进HCC增殖作用，同时与p53-R249S相互作用促进HCC生长[7]。

肝干细胞（hepatic progenitor cells，HPCs）在正常条件下是静止的，且数量很少，在肝损伤时可复制分化为肝细胞。研究者在肝肿瘤和肿瘤前病变中观察到HPCs的活化，认为HPCs也是HCC的干细胞[8]。维生素D作为一种维持机体钙和磷酸盐稳态的元素，经肝肾的联合活化成为维生素D3（VitD3）。研究发现AFB1可通过影响丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）和Hippo信号通路改变HPCs样上皮细胞系WB-344细胞；VitD3通过激活AKT和关闭Hippo信号通路，来抑制AFB1诱导HPCs的扩增，同时也验证了VitD3可作为HCC的抗癌剂[9]。含PPPDE肽酶结构域蛋白1（PPPDE1）可编码人体凋亡前表达蛋白，有研究者发现敲除PPPDE1可以显著阻断人HCC的克隆生长和致瘤性，而且PPPDE1是p53蛋白及其下游凋亡通路的关键调控因子，对p53有负性调节作用[10]。

HBV感染、强致癌剂AFB1等的相关研究，证实了HCC发生、发展与其密切相关，从而促使人类采取一定措施来预防，如HBV疫苗的普及、避免含AFB1食物的摄入等。

1.2 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）相关基因研究AFP是胎儿肝细胞产生的一种特殊蛋白——糖蛋白，它是胎儿血清的正常成分，并发现HCC细胞能合成AFP。AFP作为一种特异血清标志物，已广泛应用于HCC的筛查、临床诊断及预后复发的判断。AFP-L3（甲胎蛋白异质体）是AFP糖基化侧链修饰后的产物之一，在HCC细胞中特异性高表达[11]。研究表明AFP在HCC的细胞增殖和凋亡中发挥重要作用，AFP含量与HCC病灶体积、血管侵袭及分化程度等相关[12-13]。

miRNA是基因表达转录后具有调控作用的小分子RNA，研究者发现miR-202是一类具有抑癌基因特性的miRNA，能够靶向介导原癌基因的增殖侵袭过程并抑制其表达，进而抑制其增殖并诱导其凋亡[14]。研究显示HCC患者血清中miR-202的表达量与血清中AFP、AFP-L3的含量呈负相关，这就说明miR-202的低表达与HCC的发生密切相关[15]。AFP作为一种常规肿瘤指标广泛应用于临床，但经统计实际约30%左右的HCC患者AFP含量为阴性。AFP阴性HCC患者的基因机制如何，还需学者进一步研究。

1.3 肝癌病理分级的相关基因研究 HCC的埃德蒙森-施泰纳（Edmondson-Steiner）分级为Ⅰ～Ⅳ级，病理分级一般为高、中、低和未分化HCC，且HCC不同分化程度与预后密切相关。c-myc是myc基因家族的重要成员，c-myc既是一种可易位基因，又是一种可使细胞无限增殖、获永生化功能促进细胞分裂的基因，c-myc与多种肿瘤发生、发展有关。研究者发现HCC组织中cmyc阳性表达率在低分化HCC中高于高分化HCC，在HCC伴淋巴结转移者高于不伴淋巴结转移者[16]。c-myc是不可控型p53的诱导物，可引起p53表达减少，从而导致细胞失控增殖。

1.4 肝癌转移相关基因研究 整合素αvβ3是整合素家族中的重要成员，作为内皮细胞与细胞外基质的桥梁，通过调节内皮细胞的黏附、迁移、增殖、凋亡等功能，在肿瘤血管生成过程中发挥重要作用。转化生长因子-β1（TGFβ1）是参与肿瘤增值、侵袭转移的重要生物因子，在HCC增殖和转移中转化肿瘤细胞的生长因子，与HCC的进展有关。

研究者揭示HCC的转移与骨桥蛋白（OPN）高表达有关，OPN通过与整合素αvβ3或 CD44结合，参与细胞黏附、信号传导及运动等生物学过程；OPN在伴转移的HCC组织中呈显著高表达，通过阻断OPN的表达可延缓HCC的转移[17]。经OPN和 TGFβ1基因干扰的高转移潜能HCC的肺转移能力有明显下降，且后者下降更加明显，研究表明HCC转移潜能的下降与 OPN和TGFβ1表达减少有关，此研究成果为HCC转移和预后的基因预测奠定了基础[18]。亦有研究者发现HCC组织和细胞系中母系表达基因2（MEG2）表达降低，MEG2通过抑制AKT磷酸化从而抑制HCC的生长和转移，且MEG2表达的下调预示HCC患者的总生存率和无病生存率降低[19]。HCC的生长、转移和复发都离不开新生血管的形成，载脂蛋白 A-I结合蛋白（apoA-I binding protein,AIBP）可促进清除内皮细胞中的胆固醇，此过程可干扰血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）的功能，进而抑制血管生成[20]。HCC易发生肝内和肝外转移，如果能掌握HCC转移机制，就能为HCC治疗新靶点、为新型药物开发奠定基础，从而控制HCC复发、延长患者无病生存时间。

1.5 肝癌其他相关基因研究 HCC的形成过程极其复杂，包括染色体不稳定性、癌基因表达激活、抑癌基因沉默和DNA修复系统失活等。DNA甲基化是指胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，是重要的表观遗传学改变。通过检测转移抑制基因p15、SYK、TIMP-3、E-cadherin、RASSAF1 和肿瘤相关基因p53、RB1、WT1、p14、p16 启动子区在肝癌、癌旁和正常肝组织的甲基化情况，研究者发现HCC组织有多个基因存在甲基化，且HCC组织甲基化水平较癌旁组织高[21]。

另外影响细胞增殖、侵袭的一些基因也与HCC的发生、发展相关。亮氨酸拉链EF-hand结构域跨膜蛋白1（LETM1）和叉头框蛋白 Q1（FOXQ1）是与 HCC 细胞增殖密切相关的两类基因。LETM1编码产物是一类线粒体内膜结合蛋白，其高表达可引起线粒体糖酵解增加、腺苷三磷酸（ATP）生成增多，引起磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/AKT信号通路处于持续激活的状态，PI3K/AKT是介导细胞增殖的信号通路，与多种细胞的异常增殖相关[22]。FOXQ1是叉头框转录因子家族的一员，涉及胚胎发育、糖类和脂类代谢、细胞周期调控等过程；其突变与肿瘤发生有关。FOXQ1可靶向下游cyclinD1、cmyc的启动子区域并启动基因的转录过程[23]。

跨膜蛋白3（IFITM3）是与HCC细胞侵袭相关的基因，IFITM3属于干扰素诱导基因ISG，可以被干扰素和病毒诱导表达。IFITM3编码产物是一类跨膜蛋白，可通过酪氨酸激酶（JAK）/STAT3信号通路增加基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达，通过MMP-9水解胶原蛋白和层粘连蛋白的功能造成胞外基质降解，促进细胞侵袭[24]。

多种基因相关研究为解开HCC的发生、发展打开了大门，通过人类的逐步认识及持续研究，HCC基因靶向治疗相关研究也取得较快的发展。

2 HCC基因靶向治疗相关研究

实验常规细胞试剂：正常肝细胞株L02，AFP阳性人肝癌细胞株HepG2和Hep3B，AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721，AFP阴性的人宫颈癌 HeLa细胞。基因载体 pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK、p[HRE]AFP-Luc。

研究者通过构建 AFP启动子驱动的双自杀基因（CD，TK）+AIBP基因过表达载体 pcDNA3.1-AFPAIBP-yCD/TK，并分别转染Hep3B和SMMC7721，转染后Hep3B细胞生长得到明显抑制，但SMMC7721细胞生长不受影响；且AIBP表达在HCC细胞中下调，推测AIBP高表达可能抑制HCC新血管生成[25]。由此AIBP有望成为HCC抗血管生成的潜在靶点。

Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族成员，特点是其在正常组织沉默，而仅在各类肿瘤中有所表达，同样在肝癌组织中 Survivin呈高表达[26]。研究者通过AFP siRNA转染HepG2细胞，结果显示AFP表达下调，证明沉默AFP基因进而抑制Survivin表达、促进细胞凋亡[27]。通过构建 pAFP-p53-EGFP重组质粒，并转染HepG2、SMMC7721和HeLa细胞，研究者发现HepG2细胞p53蛋白表达量明显高于SMMC7721和HeLa细胞，证明p53的表达具有细胞相对专一性，pAFP-P53-EGFP载体可专一性的作用于 AFP阳性肝癌细胞，引起HCC细胞周期阻滞和凋亡[28]。

研究者构建靶向HCC自杀基因p[HRE]AFP-HSVTK和肿瘤细胞成像基因载体p[HRE]AFP-Luc，并将磁性纳米颗粒四氧化三铁-聚乙烯亚胺（Fe3O4@PEI）作为基因治疗载体和磁流体热疗的介质，结果显示Fe3O4@PEI介导的体内靶向基因治疗和磁流体热疗的联合治疗能对肿瘤细胞产生特异高效的协同杀伤作用[29]。Fe3O4@PEI即能在交变磁场中可控升温，同时又能作为基因载体对肿瘤进行基因治疗[30]。

HCC的发生、发展极其复杂，HBV感染、强致癌剂AFB1等病因研究已取得一定成果，AFP相关基因、HCC转移相关基因等多种基因也进入人们视野，但这仅仅是冰山一角。相信随着HCC基因组学的开展和深入，将会给HCC研究带来根本性变化，通过构建与HCC发生、发展、转移复发和预后相关的指标体系分子分型，为临床治疗方案的选择提供依据，研究HCC治疗新靶点为新型药物开发奠定基础，为HCC的临床治疗及预防开拓新前景。