广州市某A2/O工艺城镇污水处理厂出水对大型溞的生殖毒性作用

刘芸，胡小英，赵旭，易皓，温勇，胡国成，王炜

生态环境部华南环境科学研究所，广州 510655

城市污水处理厂废水中存在双酚A、烷基酚类、邻苯二甲酸酯类、有机磷农药、有机氯农药以及雌激素类污染物[1-4]，这些物质已报道具有内分泌干扰效应，对水生生物的内分泌系统造成影响，其中有些物质还能够通过改变雌雄激素水平而影响生物的繁殖能力。已有研究表明，城市污水与工业废水已经成为环境水体中内分泌干扰物(EDC)的主要来源[5-7]。我国现行城市污水处理厂多采用A2/O处理工艺，对化学需氧量(COD)及氨氮具有较好的去除效果，但未对其中可能存在的毒害物质进行针对性的去除。

为了解污水处理厂废水的生物毒性风险，马梅等[8]利用T3发光菌检测了某城市污水处理厂各处理段水样的急性毒性效应，发现进入一级处理前水样与处理结束后水样均表现出发光抑制毒性；黄满红等[9]利用大型溞评价了上海市3家污水处理厂污水的急性毒性效应，发现进水具有一定的急性毒性，出水毒性降低；徐晓平等[10]发现，污水处理厂不同处理单元对污水毒性减弱能力存在差异，各处理工艺出水对大型溞仍然存在一定毒性，并且还认为有必要开展污水生物毒性测试来作为判断废水水质和污水处理工艺效果的一个补充检验方法。曹楠等[11]以生物遗传毒性(UMU)和视黄酸受体(RAR)结合活性为指标，调查了城市污水的生物毒性，发现污水厂出水仍然普遍具有遗传毒性，部分污水厂出水仍残留RAR结合活性。随着尾水排放，尾水中残留的污染物可能对水生生物造成危害，因此，研究污水处理厂废水的毒性风险具有重大意义。

大型溞(Daphniamagna)是一种对水质比较敏感的浮游动物，广泛分布于淡水水域，它以浮游植物为食，又是鱼类和大型无脊椎动物的饵料，是水生态系统中物质循环和能量流动的重要环节。同时，大型溞具有诸多优点，包括生活周期短，生长快，生殖量高，易培养，对水环境胁迫敏感等，故其被广泛应用于各种毒性测试，已被证明能对重金属[12-15]、藻毒素[16-17]和杀虫剂[18-19]等多种毒性物质进行毒性表征。急性毒性实验以死亡为终点主要检测污染物的致死效应，而慢性毒性实验可以更深入地了解有毒物质对生物的长期慢性影响，其中Dao等[16]利用Daphniamagna慢性毒性方法检测了蓝藻毒素的毒性效应，发现除了致死效应，低浓度下蓝藻毒素能对大型溞的生长与生殖产生影响；李爽和徐镜波[20]的研究表明，大型溞第一次产溞时间和产溞总量是表征生殖毒性最灵敏的生理参数。大型溞慢性毒性测试已被证明适用于地表水体的毒性评价[21]。美国环保局已将大型溞用于短期慢性毒性评价，并证实这是一种有效的评价方法[22]。

综上，城镇污水处理厂废水毒性研究主要集中在急性毒性测试，慢性毒性测试的相关研究尚鲜见报道。利用大型溞开展城镇污水处理厂不同污水处理单元出水毒性检验的研究有限[23]，本研究应用大型溞14 d慢性毒性测试方法对广州地区某污水处理厂各工艺段出水进行毒性效应测试，了解城镇污水处理厂污水毒性的变化规律，从综合生物毒性角度评价现行污水处理厂A2/O工艺的脱毒减害效果。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验水样

样品采集瓶采用棕色带塞细口玻璃瓶，样品瓶经重铬酸钾洗液润洗浸泡过夜，用自来水、蒸馏水洗净后倒置晾干待用。采集的样品运回实验室后立即于4 ℃下保存，不添加任何溶剂及药品，直接取出适量进行检测。

样品采集于广州地区某污水处理厂，该污水处理厂采用A2/O工艺，于2012年12月一次性采集各工艺段出水(图1)。

图1 污水处理厂各工艺废水样品采样点示意图Fig. 1 Flow chart of wastewater sampling sites in sewage treatment plant

采集水样水质常规指标检测结果如表1所示，由表1可知，本次实验所采集水样在实验过程中常规水质指标数值未发生显著变化，说明在试验周期内水样性状较为稳定。

1.2 受试生物与培养条件

大型溞(Daphniamagna)是一种滤食动物，以绿藻、细菌或酵母为食，成熟母溞体长3～5 mm，通体透明，可以通过体式显微镜直接观察包括心跳和肠道等内部器官的情况。大型溞能分别进行孤雌生殖(外界环境适宜时)和有性生殖(外界环境恶化时)，并且产溞量高，所以大型溞适合作为生殖毒性研究的实验对象。本研究所用大型溞来源于中国科学院生态环境研究中心，已在本实验室稳定培养3代以上，在温度(22±2) ℃光照培养箱中培养，光照周期16 h L∶8 h D，大型溞的饵料为3N-BBM培养基培养的小球藻藻液。

表1 水样常规水质指标Table 1 Conventional water qualities of water sample

1.3 测试方法

本研究稀释水采用ISO-6341(1996)推荐的人工重组水作为稀释水和空白对照，具体组分如下：KCl 5.8 mg L-1，NaHCO364.8 mg L-1，MgSO4·7H2O 123 mg L-1，CaCl2·2H2O 294 mg L-1，pH 7.8±0.2。实验选用同一母体后代、出生6～24 h、个体均匀的幼体为试验用溞。怀卵母溞在产幼前转移到不加食物的水体中，从而保证受试溞未进食。

1.3.1 48 h急性毒性测试

本研究急性毒性测试参考《水质物质对溞类(大型溞)急性毒性测定方法GB/T 13266—91》，实验期间不喂食并及时移除死亡溞，每24 h更换80%试验液。

具体实验过程：试验在100 mL结晶皿中进行，每个结晶皿加入50 mL水样与1只幼溞，每个水样的3个浓度组分别设置4个平行，每个平行3个重复，空白对照使用标准稀释水，及时观察并记录大型溞运动与死亡情况，试验期间不喂食，试验温度为(24±1) ℃。测试样品浓度分别为：不稀释时浓度(用100%表示)、稀释2倍时浓度(用50%表示)和稀释10倍时浓度(用10%表示)。

1.3.2 14 d慢性毒性测试

大型溞14 d慢性毒性实验采用半静态实验，每隔24 h更换试验溶液的80%并喂食相同浓度小球藻藻液。实验在100 mL结晶皿中进行，每个结晶皿中加入50 mL水样与1只幼溞。设置100%原样品，半倍稀释(50%)样品和四倍稀释(25%)样品3个浓度组，标准稀释水作为对照组，每组设置4个平行，每个平行3个重复。记录大型溞的第一胎产溞时间、第一胎产溞数量、试验期间产溞总数及母溞死亡数。试验周期为14 d。

1.4 实验质量控制

大型溞毒性测试中，对照组未出现不活动大型溞，实验结束时水样中溶解氧浓度必须大于或等于2 mg L-1，整个试验过程温度波动范围不超过1 ℃。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS V17.0软件进行样本检验统计，用单因素方差分析(ANOVA)法分析各试验组与对照组大型溞第一胎产溞时间、第一胎产溞数量和试验周期内母溞的总产溞数量之间的均值差异，所有图片利用Excel绘制，P<0.05代表显著性差异，用*表示。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 48 h急性毒性测试

48 h急性毒性实验结果如表2所示，由表2可知，8个水样的各个稀释浓度样品，均未在48 h内对大型溞活动产生显著抑制作用，对大型溞急性毒性作用很弱。根据现场调研，该污水处理厂废水来源主要为生活污水与少量印染厂废水。已有研究显示，生活污水与印染废水对大型溞均为无显著急性毒性效应或仅有弱急性毒性效应[8,24-25]，这与本研究结果基本一致。

2.2 第一胎产溞时间

试验大型溞第一胎产溞时间如图2所示，在空白对照组中，12只大型溞的第一胎平均产溞时间9.67 d，与实验室日常养殖产溞时间以及文献报道中正常产溞时间基本一致[24]，说明在本研究采用的实验条件下，暴露组与对照组的差异是暴露样品的作用导致的。

表2 48 h急性毒性测试结果Table 2 Results of 48 h acute toxicity

图2 第一胎产溞时间注：*表示暴露组与空白组相比具有显著差异性，P<0.05；下同。Fig. 2 Mean time to the production of the first broodNote: *indicates a significant difference between treatment and blank group, P<0.05; the same below.

将暴露组与对照组的第一胎产溞时间进行组间差异分析，结果显示，从1#到5#样品所有浓度组均与对照组出现显著性差异，6#和8#样品100%浓度组与对照组比较有显著的组间差异，另外，7#样品50%稀释浓度组与对照组的产溞时间存在显著差异(图2)。

废水经过细格栅和沉砂池处理后，仅仅除去了其中体积较大的杂物，而污水中具有毒性的化学物质并未得到处理，所以，1#和2#样品暴露对大型溞存在显著的毒性作用。根据工艺图(图1)显示，3#样品为污泥回流后第一个水样，而市政污水处理设施中的污泥中含有如壬基酚等污染物能让溞类首次产溞时间延后[26]，回流污泥中的毒性物质可能溶入水体，导致3#样品暴露组与对照组产生显著差异；经过厌氧池处理，4#样品中仍存在对大型溞具有生殖毒性的物质；5#样品为缺氧池出水与好氧池废水回流后的混合物，仍显示出明显的生殖毒性，说明其中具有生殖毒性的物质未完全去除；6#样品的50%与25%浓度组第一胎平均产溞时间早于对照组，且根据实验记录显示(未在文中列出)，对照组中母溞最早在第9天开始产溞，废水样品中只有6#样品的50%与25%浓度组有大型溞在第9天开始产溞，其余样品均从暴露第10天才开始产溞，因此，废水样品总体呈现第一胎产溞时间推后的趋势。这与张泽光等[24]报道的造纸废水经传统工艺处理后各工艺段出水均能延长大型溞第一胎产溞时间的结论基本一致。经好氧池处理后的6#样品生殖毒性显著降低，说明好氧池处理是主要去除生殖毒性物质的处理工艺。7#样品为6#样品经过了物理处理后样品，二者未显示明显差异。最后经过紫外消毒后，8#样品暴露也导致大型溞平均产溞时间有所推迟，8#水样生殖毒性再次升高，可能是紫外消毒工艺过程让处理水中的某些成分再次发生了变化，并产生了毒性物质所致。因此，从整个工艺过程分析可知，经过好氧池处理的出水对大型溞的生殖毒性作用减弱。

2.3 第一胎产溞数量

对大型溞第一胎产溞量进行了统计，结果如图3所示。在100%原样浓度组中，1#～5#暴露组大型溞第一胎产溞量与对照组相比均出现显著提高，而7#暴露组第一胎产溞量显著低于对照组；50%浓度样品组中，1#、2#和6#暴露组第一胎产溞量仍显著高于对照，但与100%浓度组相比产溞量有所降低；而7#样品第一胎产溞量显著低于对照。所有样品25%稀释浓度组与对照组相比，均无显著性差异(图3)。

图3 每只母溞第一胎产溞数量Fig. 3 The number of first brood per tested Daphnia magna

图4 每只母溞暴露期产溞总数Fig. 4 Total fecundity per female Daphnia magna during exposure period

水样对大型溞第一胎产溞数量的影响主要表现为增加大型溞产溞量，并随着水处理工艺的进行差异缩小。因此，水样中应该可能存在能够刺激大型溞产溞的物质，根据文献报道，废水中部分污染物质如溴代阻燃剂得克隆[27]、除草剂苄嘧磺隆[28]长期暴露能显著增加大型溞产溞次数和产溞总数，由此判断本研究水样中可能也存在某些能够促进大型溞产溞的污染物，如具有雌激素效应的某些污染物，也可能是由于污染物之间的联合效应引起的。

从整个废水处理工艺可以看出，从进水到缺氧池出水各阶段废水均能显著提高第一胎产溞数量，经好氧池处理后毒性显著降低。

2.4 试验周期内总产溞量

为检验受试溞在第一次产溞情况受到影响后，对暴露水样是否产生适应性，从实验开始到实验结束共计14 d的时间内，每天记录每只母溞的产溞量，实验结束计算每个暴露浓度组产溞总数，与对照组数量相差20%以上认为具有显著性差异。如图4所示，在100%原水样品测试中，1#与2#样品暴露组母溞产溞总量显著高于对照组；6#和8#样品暴露组母溞产溞总量显著低于对照组；50%稀释样测试中，只有1#样品暴露组母溞产溞总量仍明显高于对照组，具有显著性差异；5#与7#样品暴露组母溞产溞总量明显低于对照组，具有显著性差异。25%稀释浓度下，只有3#和7#样品暴露组母溞产溞总量显著低于对照组水平，其余样品均未出现显著性差异(图4)。

经过1#100%水样、50%稀释水样及2#100%水样暴露，大型溞产溞量显著高于对照组，这与大型溞第一胎产溞数量整体呈上升趋势一致，也可以说明水样中存在能够刺激大型溞产溞的物质。随着处理工艺的进行，后续水样暴露后，陆续出现大型溞产溞量低于对照组的现象，这说明能够刺激产溞的污染物在后续的处理工艺中逐渐被去除，同时水体样品中也可能存在能够抑制其产溞的污染物，这部分污染物未被去除或是未完全被去除，在刺激大型溞产溞的物质不存在后，这部分抑制性污染物起到主导作用，表现出引起大型溞产溞量减少的情况。

在2.3中已经介绍过废水中部分污染物能刺激大型溞产溞，致产溞数量上升。同时，亦有研究表明，废水中也存在大量能抑制大型溞产溞的污染物，如孙凯峰[26]报道壬基酚能让溞类每次繁殖总数降低；刘青等[29]表示印楝素能抑制大型溞的生殖频率；熊勤犁等[30]报道2,2’,4,4’-四溴二苯醚(BDE47)能使大型溞总产溞数量大幅减少；邵蕾等[14]也发现重金属镉暴露能降低大型溞每胎产溞总数。

污水处理厂不同取样点污水对大型溞不存在急性毒性效应，大型溞第一胎产溞的时间、产溞量以及大型溞总产溞量能够作为对污水处理厂各工艺阶段废水进行生殖毒性评价的有效指标；在采用A2/O工艺的污水处理厂中好氧池处理工艺对生殖毒性物质去除效果最为显著，但是污水处理厂出水潜在的生殖毒性仍然应该引起关注。