淀粉中间级分的研究进展

韩文芳，林亲录，赵思明，梅冬旭，杨琪琪，李江涛,

（1.稻米及副产物深加工国家工程实验室，中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

作为多用途、可再生的天然生物聚合物，淀粉不只是许多食物的宏观成分及重要的功能性组分，亦是诸多非食品工业的重要商业原料。目前较为广泛的认识是，淀粉由α-(1,4)和α-(1,6)-糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单元所构成，含有两种主要组分，即高度分支的支链淀粉（amylopectin，AP）和基本线性的直链淀粉（amylose，AM）。AM和AP的比例及其精细结构已被认为是淀粉物化性质与功能特性的重要决定因素，因此对淀粉的加工特性以及淀粉质食品的质地、消化特性或营养价值等具有统计学的指导意义[1-3]。除AM和AP外，前期研究中发现，某些特殊基因或品种类型淀粉（尤其是高直链玉米）中存在部分异常AM和异常AP，其分子特性介于完全线性AM与高度分支AP之间，进而提出淀粉中间级分（intermediate material，IM）这一理论[4-5]。了解淀粉的组分组成对于理解淀粉的结构及功能特性具有非常重要的意义。IM作为淀粉中可能存在的重要组分，其结构及功能特性将直接影响淀粉本身的特性，本文就淀粉中IM的相关研究进展进行了综述，以期为未来淀粉组分组成及组分结构及功能特性方面研究提供参考。

1 IM的提出

随着各种测试仪器和表征手段的快速发展，国内外学者对不同来源、不同类型的天然淀粉的分子结构、颗粒内组织排列以及理化性质、功能特性等进行了诸多研究。在对淀粉结构循序渐进、不断完善、从未间断的认识过程中，学者们深刻意识到仅用以前普遍认可的AP和AM相关理论已不足以解释研究中遇到的众多实际问题。例如，采用碘显色法等测试手段所得到某些淀粉的AM含量偏高[6-9]；AM含量相近的不同品种淀粉其颗粒形态以及溶胀、结晶、糊化、老化等物化性质差异明显[10-12]；AM含量相近的不同品种大米淀粉其自身品质以及大米的食用品质、加工品质差异明显[13]；某些淀粉（尤其是高直链淀粉）存在分子特性异常的AP、AM[14-16]；全淀粉与其级分AP的分子结构（尤其是构造单元组成）存在较大的差异[17]。在这些研究的基础上，早期学者们所提出淀粉不能单纯地分为AP和AM的理论逐渐得到认可[18-19]。由此，学术界认为淀粉的分子链不完全是由AM、AP这两种完全不同的极端结构所构成，而是连续地从一种状态过渡到另一种状态[4,20]。

1943年，Kerr等首次指出玉米、马铃薯和木薯淀粉中存在着既不符合AP定义又不符合AM定义的第3种组分，并建议将其命名为IM[21]。1949年，Lansky等采用沉淀法分级时发现与正丁醇重结晶分级相比，戊醇重结晶获得的沉淀组分（可认为是AM）量更多，且其亚级的碘亲和力显著更高，而非沉淀组分（可认为是AP）的碘亲和力更低，并将这些异常现象归因于淀粉中所存在的小部分介于严格线性和高分支之间的中间物质。以碘亲和力这一间接证据首次假定IM是过渡类型的物质，可能从有长外链分支的分支化分子逐渐过渡到有相对较少分支链的长链线性分子，这种物质能够被戊醇沉淀，而不能被正丁醇沉淀。该研究立足于IM与正丁醇、戊醇的结合性质基础，可认为玉米淀粉含质量分数5%～7%的IM，并推测IM可能能够通过戊醇与正丁醇相结合的重结晶方法获得[7]。Lansky等还指出在当时所认可的双酶法合成淀粉的理念下，这种有着轻微分支的中间性质淀粉组分的存在是合理的，只是难以将其与线性链分子明确区分[7]。虽然IM概念的提出被认为能够解释某些淀粉及其级分AP、AM性质的异常，然而淀粉级分的分离方法会影响IM的组成，特别是与AM或AP一起被分离出来时影响更大。此外，IM与AP、AM在结构上的密切联系可能导致研究人员并不知道它的存在，而其他级分的分析也在无意中受到了未知影响[5,22]。正是淀粉级分组成的这种复杂性在根本上决定了IM在结构上或性质上很难得到实质性定义，其本质仍未得到明确的阐述。

2 淀粉中IM的结构特点

不少学者在分离提取AP、AM以及对二者性质进行研究时常发现一些看似偶然的异常现象，并由此推测淀粉中存在着这样一些轻度分支的AM、轻度分支的AP、链长较长的AP和链长极短的AM，并将其称之为异常AP或异常AM。大量研究指出，这种异常AP或异常AM在普通玉米、高直链玉米、燕麦、大麦、小麦、黑麦、马铃薯、菜豆籽粒和皱皮豌豆等淀粉中广泛存在[23-27]。

玉米淀粉（尤其是ae突变株的高直链玉米）中AP的分子结构一直存在争议，关于异常AP或异常AM的报道极为普遍。Montgomery等发现高直链玉米AP的大部分组成分子有着比正常AP更长的内部链和外部链，并提出ae突变株AP的不寻常性质是由比普通AP更长的线性聚合物和介于AM、AP之间的中间结构所决定的，高直链玉米淀粉中AP的分支程度比正常AP低[28]。Klucinec等对比脱支IM、AP的高效空间排阻色谱（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）图谱发现普通玉米IM的分支链类型与AP极为相似，但含有ae基因的高直链玉米IM链段组成与AP差异明显，具体表现在其含有大量的长链，分支链平均链长更长。该研究认为IM与AP有类似的结构，二者均为支化淀粉分子的亚级，各自的物化性质可能更依赖于其分支结构而非分子尺寸[29]。Whistler等从普通、高直链玉米淀粉获得了一种结构接近于AP，但分支程度更低（AP的64%）、平均链长更长、分支尺寸可能更小（黏度更低），与碘结合呈浅蓝色的IM，含量为4.5%～8.7%[30]。Erlander等用麝香草酚沉淀玉米AM并离心去除AP后在上清液中回收得到一种低分子质量的成分，该成分分支程度与AP类似[31]。Baba等在采用化学方法和酶法分析高直链玉米淀粉时，发现其AP平均链长较蜡质玉米AP长，且外链分支度更小[32-33]。Boyer等也指出ae/wx双突变玉米淀粉中存在与ae淀粉类似的异常AP，内链长为52 个葡萄糖单元或外链较少、较长，分支较为松散[24]。尽管高直链玉米淀粉异常AP的精确结构尚不完全清楚，但其存在已被认为是ae突变玉米淀粉高AM含量（可达85%）的原因，即长外链分支成分的存在会导致碘亲和能力增强使得AM含量被过高估算[24-25]。

另有报道指出异常AP是含有短链的AM，而AM的异常会影响淀粉的结构与性质。例如，AM的含量会因短链AM的出现而被低估[23,34-35]。Banks等曾指出尽管不同淀粉IM之间的差异显著，但玉米淀粉中IM的类型和数量主要由淀粉AM的比例决定[34]。Adkins等用正丁醇沉淀法制备玉米淀粉AM时从上清液（理论上是AP）分离出一种能与碘络合的葡聚糖，该组分具有特征性的短链，被认为是链长较短的AM，其平均链长为58，所占比例随着AM含量增加而增多[23]。Takeda等对玉米AM级分在正丁醇溶液中进一步分离，发现有少量高分子质量的分支成分仍在上清液中，该物质被认为是含有一部分分支短链的AM亚级组分，它们可能形成较小的、不完全的簇结构[35]。

Baba等指出高直链玉米淀粉中除AP外还存在另一种不能与正丁醇形成复合物的组分，其平均聚合度为250～300 个葡萄糖单位，有4～5 条平均链长为50 个葡萄糖单位的分支链连接在有着100～150 个葡萄糖单位的主链上，与前人所指出的高AM中存在异常葡聚糖IM的提议一致。该研究将高直链玉米IM认为是分子质量较小、分支少但分支平均链长较长的葡聚糖[32-33]。Yun等发现ae/wx双突变玉米淀粉有小部分不能被伴刀豆球蛋白A所沉淀的组分，其特性是分支度和平均链长介于AP和AM之间的低分子质量葡聚糖[36]。Wang等也发现IM与AP一起存在于正丁醇沉淀AM后的上清液中，对其采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）分级发现IM为一分支组分，与碘的络合特性上区别于AP和AM，分子尺寸比AP小，具有与AP相似的链的类型，但分支程度比AP低、链长比AP更长，不同链的比例与突变株的种类有关。其中脱支IM、AP的HPSEC图谱表明二者的分支链段组成存在明显差异，IM的高分子组成链段更长且更多，即IM较AP分支程度更低、平均链长更长。除了IM比AP有更多短链，AP比IM有更多聚合度为16～30的链以外，二者的分子结构相似。该研究还指出ae基因存在时会导致AP和IM的分支程度均减少，且对IM分支程度的影响比AP大[37]。

Bertoft等发现在两倍体和三倍体突变株玉米淀粉中含有较高含量的IM。与AP相比，IM分支链的分布有一些改变，抗α-淀粉酶水解的能力明显增强，在甲醇溶液中α-糊精的性质也有所差别。该研究认为IM具有较规律性的分支结构，能够抵抗α-淀粉酶的水解，会引起淀粉分子整体性质发生改变[38]。Waduge等研究发现，在小麦胚乳发育过程中存在IM，认为IM可能对于我们理解一些突变株植物的淀粉合成有非常重要的意义[27]。

皱皮豌豆淀粉也是一个AM含量增加的典型，其IM被描述为极短的线性AM链与长分支链AP的混合物[18,24,39]。Colonna等从皱皮豌豆淀粉中分离得到了一种分子质量很低且具有分支的成分，与AP链的类型相似，但其碘蓝值较高，短链与长链两者数量的比例较低，且长链比例随分子质量的降低而增加[39]。Biliaderis报道了皱皮豌豆淀粉中存在长链的IM结构[40]。Matheson等发现皱皮豌豆淀粉中的IM外链和内链较光滑豌豆淀粉AP长[41]。然而，学者们对于皱皮豌豆淀粉IM的本质观点也并不相同，Bertoft等认为IM是分子尺寸与簇相当的分支物质，具有高比例的长链，其分子结构与AP的簇结构相似。一般认为簇是由更小的类似簇的结构组成，其间通过长链连接，这样就增加了长链的比例[42]。

Banks等在分级燕麦、小麦淀粉时，从AP组分中分离出一种AM-百里香酚的复合物，将此复合物在丁醇溶液中沉淀，分离出沉淀（异常AM）和另一种可溶性组分（异常AP）。异常AP占淀粉的4%～5%，碘亲和力为0.2～2.6，性质基本与普通AP相似，比AP分支更少、链长更长、β-极限水解值更大；异常AM占淀粉的2%～4.5%，碘亲和力为8.5～12.5，与普通AM相比，其β-极限水解值更小，（β+α）-极限水解值约95%，这表明该组分带有分支，但分支点之间的距离较正常AP要大得多。该研究还指出黑麦、大麦淀粉也含有异常AP，但不含异常AM[14]。Hizukuri等也报道了小麦淀粉带分支的异常AM分子，其分子尺寸比线性AM大1.5～3.0 倍，β-极限糊精也与线性AM具有非常相似的特性，可见其分支链大部分是短链[43]。Wang等发现燕麦淀粉中存在一些对碘具有异常亲和力的中间性质物质，IM在结构上接近于AP，但经脱支后测得各分支组分的链长均较AP更长[37]。Gomand等研究不同品种黑麦淀粉时，采用GPC分析发现IM中大分子质量组分性质类似AP但分支链更长，而小分子质量组分的性质类似于AM，但分子质量更大[44]。

Geddes等发现马铃薯淀粉中存在能够与碘络合的异常AP（1%～5%），其β-水解性质、链长与AP的降解产物相似[45]。Schwall等发现淀粉分支酶活力受抑制会导致马铃薯AM含量增加，AP单元链长增加、分支链延长[46]。Yoon等在密度梯度离心分级AP、AM时发现普通玉米、高直链玉米、普通大米、马铃薯和木薯淀粉中存在沉降系数小于AP且大于AM的中间物质，其浮力密度、碘结合性质介于AP、AM之间，所占比例为5.55%～13.53%。在糯玉米、糯米中并未发现此类IM的存在[47]。

杨泽敏分离IM、AP、AM后，经扫描电子显微镜放大观察发现，AM由较小的疏松颗粒堆积而成，颗粒间的间隙较小，似面包屑；AP为极细小的微粒组成的玻璃状物质，横断面可见极细的裂纹；IM似薄膜状，处于二者的过渡状态，与AP和AM的形态特征均有明显差异，在薄膜的下层隐约可见似AM的颗粒，其上层似乎偏向AP，但其质地较AP粗糙、微粒较大，但这种状态看来并非AM、AP的简单混合，它的成分自成一体、过渡自然，IM的横切面可见较大的裂纹[48]。Ma等探讨了IM、AP和AM和对淀粉球晶形成及其微观结构的影响，结果表明每个淀粉级分所占的比例以及各自的结构都极大地影响了淀粉级分及其混合物的球状结晶，样品中线性分子与分支分子的比例越高，其形成的球晶数量越多且热稳定性越高。除了分支的存在，球状结晶的内部结构和热特性也受分支度、链长和链长分布等其他因素的影响[49]。

由此可见，不同淀粉中IM的结构存在差异，鲜有学者对其进行明确的定义和阐述。ae突变株玉米的IM最为人所熟知，这类IM据报道是分子质量介于AM、AP之间，由与AP类似的链组成的分支聚合物，与AP的主要区别在于长链更长、长链与短链两者数量的比值更大。一个复杂的事实是存在IM的淀粉其所含正常AP组分的结构通常也发生了变化，有多少分支结构应该被认定为中间范畴的IM可能难以确定。而IM作为一个单独的第3组分从淀粉中被分离时，因实验室分离方法与操作的差异也会极大地影响IM的结构[50]，也可能因为人为因素而将AP或AM的结构描述为IM[51]。

3 IM的分离方法及性质

目前，学术界普遍认可天然淀粉主要由AP、IM、AM组成，其连续性的结构是由高度分支的大分子连续过渡到小分子质量的线性分子所组成，即AP、AM可能是通过IM逐渐过渡变成彼此。而IM则被定义为结构介于AM和AP之间的过渡性葡聚糖，是分支度较低、链长较长的淀粉级分[4-5,39,52]。尽管IM的提出为淀粉理论领域提供了新的研究视角，但其针对性的研究一直极为欠缺，这主要是受限于淀粉这种高分子葡萄糖聚合物本身极为复杂的分子结构。由于IM的分子特性介于AP和AM之间，其物化性质也与AM、AP都颇为相似。因此，将处于两种完全不同结构的线性AM与高度分支AP分离容易，而能够较好地将AP、AM与分子结构、性质均处于过渡状态的IM进行明确分离的相关报道仍然很少。IM的分离、结构及性质等总结见表1。

表1 IM的分离方法、结构及性质Table 1 Currently available methods for separation of IM as well as its structure and properties

Yoon等采用密度梯度离心分析淀粉级分性质时发现IM在高直链玉米（13.5%）中的比例较普通玉米（11.4%）更高，在普通大米、马铃薯和木薯淀粉中所占比例依次为5.8%、8%、5.6%，其碘结合吸收值与AP相近，浮力密度介于AP、AM之间[47]。Wang等经正丁醇沉淀法分级得到的燕麦IM与碘结合呈深蓝色，与AM-碘显色相近但颜色更浅，且碘亲和力、碘蓝值、特性黏度等特征值均略大于AP[37]。Klucinec等采用正丁醇-异戊醇从4 种不同类型玉米淀粉分离IM的得率为6.8%～7.9%，碘蓝值为0.21～0.63（AP 0.12～0.49、AM 1.17～1.30），最大吸收波长λmax为588～597 nm（AP 559～583 nm、AM 643～655 nm）[29]。Gomand等发现不同品种黑麦淀粉其IM的含量、性质、结构均有差异。其中，IM所占比例为3.2%～6.2%，碘蓝值0.57～0.71（AP 0.06～0.08、AM 1.11～1.17），λmax为646～655 nm（AP 523～538 nm、AM 654～671 nm）[44]。

国内学者杨泽敏采用正丁醇-百里酚相结合的分步沉淀方法对稻米淀粉进行分级，其基本原理如下：二甲基亚砜是淀粉的最佳溶剂，稻米粉在其中的不溶物也可称作非淀粉成分；正丁醇不会与带分支的成分形成复合物，对AM有专一性；百里酚能沉淀AM，但同时也可与稍带分支的成分（IM）形成复合物；乙醇可使溶液中的淀粉沉淀[48]。实验发现不同稻米品种IM在淀粉中所占比例差异明显（1.30%～6.07%），这种差异可能与大米品质有一定关系。研究人员认为IM与AP、AM性质之间的差异可能为揭示稻米品质差异提供新的研究方向。然而，该研究也指出这种化学分级方法难免会造成分离过程中不同成分的损失，甚至AP分子链段的降解[54-55]。金丽晨等采用GPC收集了并分析了稻米淀粉的3 种组分，认为稻米的食味品质是淀粉各组分链长结构的综合表现，其中AP的链结构起主要的决定作用，IM、AM有一定的影响，且三者的长链含量均与食味品质呈极显著负相关。该研究还提出不同品种淀粉3 种组分的长链分布差异，特别是IM长链含量及比例也许是造成其表观AM含量相近，但食味品质差异较大的主要原因[56]。曾红华、吴平等采用差示扫描量热分析锥栗原淀粉及3 个组分的热力学性质，发现在冰晶熔化、糊化、熔融裂解等糊化过程中糊化温度、吸热焓等参数值与各自的结晶程度保持一致，依次为原淀粉＞AM＞IM＞AP。研究还指出不同湿热处理温度对原淀粉、AP、AM的回生性质有较大的影响，但对IM几乎没有影响，可能的原因是热能对轻度分支型分子（IM）的脱支作用有限，这些分支链的存在会阻碍冷藏过程中重结晶乃至双螺旋堆积晶体的形成[57-58]。

淀粉的分级方法会影响级分的组成，特别是IM与AP或AM一起被分离出时影响更大。Tziotis等曾指出GPC或醇沉淀法分离不同类型玉米淀粉级分都不能实现明确分级，而不同来源淀粉IM经HPAEC获得的分支链长分布状况取决于如何定义IM[5]。曾红华[57]、梅其明[59]等则指出即使采用差别不大的多步沉淀法所获得玉米、锥栗淀粉AM、IM和AP的微观结构、碘结合性质、结晶性质以及聚合度、平均链长和平均链数也存在较大的差异。虽然IM作为淀粉的重要组成级分已日渐进入淀粉领域的研究视线，但学术界对IM仍缺乏足够的重视，其分子结构与理化性质尚无明确的描述，根本原因在于淀粉结构的复杂导致明确分级的难以实现。

4 结 语

虽然学术界认可IM在淀粉中广泛存在，认为其含量与结构对其功能特性起到了重要的作用，并有助于帮助了解淀粉的合成过程；但IM自身的分子结构、在淀粉颗粒结构中与AP和AM的结合状态、在淀粉多层次结构中的作用及对淀粉的理化性质的影响尚未得到明确的阐述。目前对于IM的研究难点主要在于IM级分的分离与纯化、准确且可信的定义及明显区别于AM和AP的分子结构特点等，理清这些难点将对IM的研究将起到至关重要的作用，也对研究淀粉中普遍存在的一些异常现象有更加清晰的解释和理解，有助于促进淀粉科学的发展。