高温蒸汽处理对余甘子果汁贮藏期间的品质影响及褐变行为解析

徐 涓，张雯雯，李 凯，李 坤，刘兰香，马金菊，甘 瑾，张 弘

（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业和草原局特色森林资源工程技术研究中心，云南 昆明 650224）

余甘子（Phyllanthus emblica L.），别名庵摩勒迦果、山油柑、滇橄榄等，是大戟科叶下珠属灌木或落叶小乔木植物，因其初入口味酸涩、后回甜生津而得名[1-2]。在我国余甘子的主要产地为福建、海南、云南、广东、广西、四川、贵州等省，作为药食兼用植物，也被世界卫生组织指定为在全世界推广种植的保健植物之一，近年来被大量栽培，资源丰富[3]。中医学认为余甘子具有利咽生津、化痰止咳、护肝、改善动脉硬化、抗氧化、抗菌、抗疲劳、抗糖尿病、抗肿瘤等功效[4-7]，且其果实中含有丰富的多酚、多糖、维生素以及黄酮等化合物[8-10]。余甘子主要用于功能饮料（如余甘子果汁和果酒饮料）和功能食品（余甘子含片、余甘子果粉等）[11]的开发，而较常见的加工方式是将余甘子榨汁，但果汁在贮藏过程中，褐变现象严重，不仅产品颜色发生变化，其营养成分也发生不同程度的损失，降低了余甘子产品的商品价值。为了保留余甘子的有效成分，使其价值最大化，需采取有效措施控制余甘子果汁的褐变现象。普遍认为果汁在加工和贮藏过程中的褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，可通过热处理或添加抗氧化剂等方法来抑制酶促褐变的发生[12-13]，潘少香等[14]的研究结果表明蒸汽热烫处理后的生姜汁能保持良好的色泽、高含量的总酚和姜辣素以及生姜的典型香气成分；汪良峰等[15]发现合适的蒸汽处理苹果果浆，可达到灭酶防褐变、改善果浆品质的效果；而非酶促褐变较复杂，目前认为导致非酶促褐变的主要原因有：VC氧化分解、多酚类物质氧化聚合反应、美拉德（Maillard）反应以及焦糖化反应等[16-17]。陈雪梅等[18]研究了5 ℃贮藏条件下余甘子中没食子酸、单宁酸等成分含量的变化；甘瑾等[19]检测余甘子果汁在贮藏过程中VC含量的变化；但目前余甘子果汁在贮藏过程中的褐变反应类型及其内源因子尚不清楚，导致实际控制褐变的措施缺乏针对性和有效性。

通径分析是一种多变量分析方法，能有效地得出相关变量间因子对结果的直接影响效应，同时能推导出自变量与因变量间的间接效应，从而能直接比较各因素的相对重要性[20-21]。本研究通过高温蒸汽预处理钝化余甘子果中的酶活性，检测果汁在4、25、37 ℃贮藏条件下，VC、总酚、总糖、还原糖和5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）质量浓度的变化，并利用通径分析方法进一步解析余甘子果汁在贮藏过程中引起褐变的主要因素和各因素间的交互作用，以期为品质调控技术及有效控制其褐变提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

余甘子鲜果由中国林业科学研究院资源昆虫研究所景东南亚热带试验站提供。

抗坏血酸（标准品）、葡萄糖（标准品）、没食子酸（标准品）、2,6-二氯靛酚钠盐、蒽酮 阿拉丁试剂上海有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、碳酸钠天津市风船化学试剂科技有限公司；硫酸、无水乙醇重庆川东化工（集团）有限公司；福林-酚、芦丁（标准品） 北京索莱宝科技有限公司；以上试剂除标准品外其余均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HX-7.5D小型电加热蒸汽发生器 上海华征特种锅炉有限公司；BPZ-6090Lc真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；BCD-539WT冰箱 青岛海尔股份有限公司；1200高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司；高速冷冻离心机 德国HERMLE科技公司。

1.3 方法

1.3.1 余甘子果汁制备

余甘子鲜果（直径约为10～15 mm）经挑选清洗后，置于蒸汽压力为0.3 MPa的高温蒸汽中处理130 s[22-23]，取出，立即冷却，去核，螺旋榨汁，离心过滤备用（标为D样）。对照样品：余甘子鲜果挑选清洗后直接螺旋取汁，离心过滤备用（标为W样）。

1.3.2 余甘子果汁的贮藏

将1.3.1节的余甘子果汁巴氏灭菌后分装，分别置于4、25、37 ℃避光贮藏42 d，每隔7 d取余甘子汁用于各项指标的测定。

1.3.3 褐变度的测定

褐变度的测定参考文献[24]的方法。取余甘子果汁1 mL用去离子水稀释10 倍后，4 ℃、8 000 r/min下离心10 min，取上清液，在420 nm波长处测定吸光度，以A420nm表征其褐变度。

1.3.4 成分质量浓度测定

VC质量浓度采用2,6-二氯靛酚钠标定法[25]检测，单位为mg/mL；总酚质量浓度采用福林-酚比色法[26]进行测定，以每毫升余甘子果汁中的没食子酸质量来表示，单位mg/mL；5-HMF质量浓度的测定参照Li Zhao等[27]的液相法，单位为μg/mL；采用蒽酮比色法[28]测定余甘子果汁中的总糖质量浓度，以每毫升余甘子果汁中的葡萄糖质量来表示，单位mg/mL；还原糖质量浓度的测定参照赵凯等[29]的方法（3,5-二硝基水杨酸法），以每毫升余甘子果汁中的葡萄糖质量来表示，单位mg/mL。

1.4 数据处理与分析

以VC（X1）、总酚（X2）、5-HMF（X3）、还原糖（X4）质量浓度为自变量，以褐变度为因变量Y，对引起余甘子果汁褐变的各因素进行通径分析，求出直接通径系数P1、P2、P3、P4，按式（1）计算各因素间的间接通径系数Pij，由相关系数和通径系数计算决定系数d[30-31]，单个因素（i）、两个因素（i、j）对Y的决定系数计算分别如公式（2）、（3）所示，剩余通径系数（Pe，未考虑因变量的影响因素和实验误差）的计算如公式（4）所示。

式中：Pi为因素i的通径系数；Pj为因素j的通径系数；rij为因素i和j的相关系数。

每个指标测定3 个平行样，实验数据采用Origin 8.0软件绘图，利用SPSS 17.0软件进行相关性分析、通径分析和差异显著性分析（方差分析），P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高温蒸汽处理对余甘子果汁贮藏过程中VC、总酚质量浓度的影响

如图1A所示，VC虽在余甘子果汁中含量丰富，但在长期受热过程中并不稳定，且随着贮藏温度越高，损失越严重。VC的降解主要为有氧降解和无氧降解，体系中的含氮物质（如氨基酸、蛋白质等）会与VC的氧化产物进一步发生羰氨反应，从而加速样品的褐变[13]，植物体内VC分解酶的存在也会促进VC氧化[32]，致使其质量浓度降低。余甘子果汁在4、25 、37 ℃下贮藏42 d后，W样的VC保留率分别为77.67%、64.43%和61.76%，D样VC保留率分别为80.80%、67.47%和63.69%，可见W样和D样在4 ℃贮藏条件下VC保留率明显高于25 ℃和37 ℃，故低温条件下更利于余甘子果汁的贮藏。在4 ℃贮藏42 d后，D样VC质量浓度显著高于W样（P＜0.05），可能因为样品经过高温蒸汽预处理后可钝化其中的VC酶，同时使果汁中的部分含氮物质变性，从而减缓VC的损失。

由图1B可知，余甘子总酚质量浓度随着贮藏时间的延长而下降，且随着贮藏温度的升高总酚质量浓度下降，37 ℃贮藏42 d后，W样和D样总酚质量浓度分别下降了9.38、8.90 mg/mL，酚类物质质量浓度减少是其氧化聚合和多酚氧化酶的酶促反应导致，而W样总酚保留率低于D样，可能是由于W样中的酚类发生酶促反应同时还伴有氧化聚合，高温蒸汽处理可钝化多酚氧化酶[33]，故D样中的总酚质量浓度减少可能主要由氧化聚合所导致，可见，高温蒸汽预处理和低温贮藏利于余甘子果汁中酚类物质的保留。

图1 余甘子果汁贮藏期间VC（A）和总酚（B）质量浓度的变化Fig. 1 Changes in vitamin C (A) and total phenol (B) concentration of Phyllanthus emblica L. juice during storage

2.2 高温蒸汽处理对余甘子果汁贮藏过程中总糖和还原糖质量浓度的影响

如图2A所示，贮藏期间余甘子果汁总糖质量浓度随着时间的延长而降低，且与贮藏温度呈负相关。贮藏42 d后，4 ℃贮藏的W样和D样果汁总糖保留率分别为88.72%和89.70%，而37 ℃条件下贮藏的余甘子果汁总糖的保留率分别为82.67%和82.91%，37 ℃条件下的总糖质量浓度显著低于4 ℃条件下（P＜0.05）。总糖的损失主要是由于酸性和热处理的条件会导致蔗糖水解生成还原糖，还原糖进一步与氨基酸进行Maillard反应[34]。

图2 余甘子果汁贮藏期间总糖（A）和还原糖（B）质量浓度的变化Fig. 2 Changes in total sugar (A) and reducing sugar (B) concentration of Phyllanthus emblica L. juice during storage

由图2B可知，余甘子果汁在贮藏过程中还原糖质量浓度的变化较复杂，在4 ℃下0～21 d，还原糖质量浓度随着贮藏时间的延长而降低，但第28天还原糖质量浓度略有上升，35 d后开始下降；在25 ℃和37 ℃均有类似的变化规律，不同的是上升的时间点提前至14 d。余甘子果汁在贮藏期间，与还原糖质量浓度变化有关的反应主要有蔗糖水解反应生成还原糖和Maillard反应消耗还原糖，当水解反应占主导地位时，还原糖质量浓度出现上升趋势，反之还原糖质量浓度下降。不同温度贮藏42 d后，W样还原糖质量浓度显著高于D样，可能是贮藏期间D样总糖水解速率低于W样，其还原糖的生成量低所致。

2.3 高温蒸汽处理对余甘子果汁贮藏过程中5-HMF质量浓度的影响

图3 余甘子果汁贮藏期间5-HMF质量浓度的变化Fig. 3 Changes in 5-HMF concentration of Phyllanthus emblica L.juice during storage

5-HMF是Maillard反应过程中极为重要的中间产物之一，不仅是造成果汁褐变的潜在因素，同时也是Maillard反应的重要指示因子[35]；因此，5-HMF质量浓度可作为褐变程度的评价指标之一。如图3所示，5-HMF质量浓度与贮藏温度正相关。同时，5-HMF质量浓度随贮藏时间的延长而增加。贮藏42 d后，W样在4、25 、37 ℃下5-HMF质量浓度分别增加1.58、4.81 μg/mL和10.38 μg/mL，37 ℃下5-HMF的生成量显著高于4 ℃（P＜0.05）；同样条件下放置42 d后，D样5-HMF的增量分别为1.26、2.84 、5.92 μg/mL。在25 ℃和37 ℃贮藏条件下D样的5-HMF生成量明显低于W样，可能原因是高温蒸汽使余甘子中的部分蛋白变性，抑制了Maillard反应的进行，致使D样的5-HMF生成量较低。由图可知，4 ℃条件下贮藏W和D样的5-HMF的增量均较小，有利于果汁的贮藏。

表1 不同贮藏温度下W样和D样各因素间的相关系数Table 1 Correlation coefficients among factors for samples W and D at different storage temperatures

2.4 高温蒸汽处理对余甘子果汁贮藏过程中褐变度的影响

图4 余甘子果汁贮藏期间的褐变度Fig. 4 Browning curves of Phyllanthus emblica L. juice during storage

由图4可知，随着贮藏温度的升高，果汁的褐变加剧。贮藏42 d后，在4、25 ℃和37 ℃下W样的A420nm分别增加0.101 2、0.202 5和0.335 7，D样分别增加0.051 2、0.120 7和0.165 5，相同贮藏时间37 ℃处理组褐变度显著高于4 ℃处理组（P＜0.05）。另外，贮藏时间越长，褐变越明显。因此，低温贮藏可有效减少余甘子果汁的褐变度。

2.5 相关性分析

由表1可知，4 ℃贮藏温度下，两各处理组的总酚（X2）、5-HMF（X3）和还原糖（X4）质量浓度均与褐变度（Y）显著或极显著相关，其中W样的褐变度与总酚（X2）和还原糖（X4）质量浓度呈极显著负相关（P＜0.01），与5-HMF质量浓度（X3）呈显著正相关（P＜0.05），VC质量浓度（X1）与褐变度（Y）相关性不显著。25 ℃贮藏温度下，W样和D样的VC（X1）、总酚（X2）和5-HMF（X3）质量浓度均与褐变度（Y）呈极显著相关（P＜0.01），W样的还原糖质量浓度（X4）与褐变度（Y）呈显著负相关（P＜0.05），而D样的还原糖质量浓度（X4）与褐变度（Y）相关性不显著。37 ℃贮藏温度下，W样和D样的还原糖质量浓度（X4）与褐变度（Y）相关性不显著，其余3 个因素均具有一定的相关性，其中W样的VC（X1）、总酚（X2）和5-HMF（X3）质量浓度均与褐变度（Y）呈极显著相关（P＜0.01），而D样只有VC（X1）、总酚（X2）质量浓度与褐变度（Y）呈极显著相关（P＜0.01），5-HMF质量浓度（X3）与褐变度（Y）呈显著相关（P＜0.05）。

2.6 不同贮藏条件下余甘子果汁褐变的通径分析

各因素间的相关系数只能表明两因素间的直接关系及相关程度，但不能完全确定各因素对余甘子果汁褐变的相对重要性；因此，为了进一步探讨不同贮藏条件下引起W样和D样余甘子果汁褐变的主要因素，对其进行通径分析，再根据通径系数分析各因素的相对重要性。直接通径系数Pi反映因素Xi对Y的直接效应，Pi绝对值越大，表明因素Xi对Y的作用越大，反之亦然；间接通径系数Pij表示因素Xi通过Xj（i≠j）对Y的作用，Pij绝对值越大，表明因素Xi通过Xj（i≠j）对Y的影响越大。

表2 W样在不同贮藏温度下的通径分析Table 2 Path analysis among factors for samples W and D at different storage temperatures

在4、25、37 ℃贮藏条件下，因素VC（X1）、总酚（X2）、5-HMF（X3）、还原糖（X4）质量浓度与褐变度之间的通径分析见表2。对于W样，在4 ℃贮藏条件下，直接通径作用的关联程度为P2＞P4＞P3＞P1，还可看出总酚质量浓度通过VC、5-HMF和还原糖质量浓度对褐变度产生的间接作用也很明显，而VC质量浓度通过其他因素对褐变度产生的间接作用相对较弱；在25 ℃贮藏温度下，由直接通径系数可知，对余甘子果汁的褐变度起首要作用的是总酚质量浓度（P2＝-2.204 4），其次是还原糖质量浓度（P4＝1.114 5），再次是VC质量浓度（P1＝0.193 3），而5-HMF质量浓度所起的作用较小（P3＝-0.049 7）；在37 ℃贮藏温度下，各因素对余甘子果汁的褐变度影响的大小顺序为P2＞P1＞P4＞P3，由表2还可看出总酚质量浓度通过VC、5-HMF和还原糖质量浓度对褐变度产生的间接作用也很明显，而5-HMF质量浓度通过其他因素对褐变度产生的间接作用相对较弱。由此可知，W样在4、25 、37 ℃贮藏条件下，对余甘子果汁的褐变度起首要作用的均是总酚质量浓度，可能原因是在本体系中，相比VC氧化反应和Maillard反应，多酚的氧化聚合和酶促反应更易发生。

从表2中得知，对于D样，在4 ℃贮藏温度下，由直接通径系数可知，对余甘子果汁的褐变度起首要作用的是5-HMF质量浓度（P3＝0.825 7），其次是还原糖质量浓度（P4＝-0.568 3），再次是总酚质量浓度（P2＝0.552 7），而VC质量浓度所起的作用较小（P1＝-0.166 0）；在25 ℃贮藏温度下，各因素对余甘子果汁的褐变度影响的大小顺序为P2＞P3＞P4＞P1，由表2还可看出总酚质量浓度通过VC、5-HMF和还原糖质量浓度对褐变度产生的间接作用也很明显，而VC质量浓度通过其他因素对褐变度产生的间接作用相对较弱；在37 ℃贮藏温度下，对余甘子果汁的褐变度起首要作用的是VC质量浓度（P1＝-1.712 6），其次是5-HMF质量浓度（P3＝-1.568 4），再次是总酚质量浓度（P2＝-1.212 5），而还原糖质量浓度所起的作用较小（P4＝0.488 0）。

由表3可知，在4 ℃贮藏条件下，将W样各因素对余甘子果汁褐变度的决定系数按照绝对值由大到小的顺序排列可知，总酚质量浓度和5-HMF质量浓度的交互作用是影响其褐变的第一决定因素，d23＝-0.696 1；总酚质量浓度和还原糖质量浓度的交互作用是影响褐变度的第二决定因素，d24＝0.639 1；总酚质量浓度是影响褐变度的第三决定因素，d2＝0.619 4；其余以此类推；通过Σd来判断通径分析中设置的自变量的合理性，Σd理论值为1，但由于实验中很难考虑到所有的影响因素及不可避免的误差，Σd不可能达到1，只能保证Σd尽可能地接近1，此时通径分析的结果才越符合实际情况。W样在4 ℃贮藏条件下Σd＝0.901 9，Pe＝0.313 2，说明影响余甘子果汁褐变的主要因素已基本考虑。由D样的决定系数可知，4 ℃下5-HMF质量浓度和总酚质量浓度的交互作用是影响余甘子果汁褐变的第一决定因素，d23＝-0.897 4；5-HMF质量浓度和还原糖质量浓度的交互作用是影响其褐变的第二决定因素，d34＝0.690 2；5-HMF质量浓度是影响其褐变的第三决定因素，d3＝0.681 8，其余以此类推；Σd＝0.818 6，Pe＝0.425 9，说明影响余甘子果汁褐变的因素还有部分未考虑到。

表3 不同贮藏温度下W样和D样的决定系数Table 3 Determination coefficients for samples W and D at different storage temperatures

25 ℃下，由W样的决定系数可知，总酚质量浓度是影响余甘子果汁褐变的第一决定因素，d2＝4.859 2；总酚质量浓度和还原糖质量浓度的交互作用是影响其褐变的第二决定因素，d24＝-4.607 0；还原糖质量浓度是影响其褐变的第三决定因素，d4＝1.242 2，其余以此类推。对于D样而言，总酚质量浓度是影响余甘子果汁褐变的第一决定因素，d2＝7.258 7；总酚和5-HMF质量浓度的交互作用是影响其褐变的第二决定因素，d23＝-7.266 1；总酚质量浓度和还原糖质量浓度的交互作用是影响其褐变的第三决定因素，d24＝-5.855 9，其余以此类推；Σd＝0.971 8，Pe＝0.167 9，说明已涵盖影响余甘子果汁褐变的主要因素。

贮藏温度达到37 ℃时，总酚质量浓度是影响W样余甘子果汁褐变的第一决定因素，d2＝0.774 8；VC质量浓度和总酚质量浓度的交互作用是影响其褐变的第二决定因素，d12＝0.752 3；总酚质量浓度和还原糖质量浓度的交互作用是影响其褐变的第三决定因素，d24＝-0.665 2，其余以此类推。由D样的决定系数可知，VC质量浓度和5-HMF质量浓度的交互作用是影响余甘子果汁褐变的第一决定因素，d13＝-5.293 7；VC质量浓度和总酚质量浓度的交互作用是影响其褐变的第二决定因素，d12＝3.795 0；5-HMF质量浓度和总酚质量浓度的交互作用是影响其褐变的第三决定因素，d23＝-3.507 1，其余以此类推；Σd＝0.958 7，Pe＝0.203 2，说明已包含影响余甘子果汁褐变的主要因素。由表3可知，不同贮藏温度下，余甘子果汁褐变与多酚质量浓度密切相关；因此，可从保留多酚的角度入手，控制余甘子果汁的褐变，为后期余甘子产品的开发提供数据支撑。

3 结 论

本研究结果表明，不同贮藏条件下，高温蒸汽预处理可减缓贮藏过程中余甘子果汁的VC、总酚及总糖质量浓度的损失，并降低5-HMF的生成量及果汁的褐变度，且低温贮藏更有利于果汁成分的保留。在4、25、37 ℃贮藏条件下，将余甘子果汁W样和D样中的VC、总酚、5-HMF和还原糖质量浓度与褐变度进行通径分析，结果表明：1）在4 ℃贮藏条件下，W样中的总酚质量浓度对褐变度起首要作用，总酚质量浓度和5-HMF质量浓度的交互作用是褐变度的第一决定因素；对于D样来说，5-HMF质量浓度对褐变度起首要作用，5-HMF质量浓度和总酚质量浓度的交互作用是褐变度的第一决定因素。2）在25 ℃贮藏条件下，总酚质量浓度对W样和D样的褐变度起首要作用，同时也是决定褐变度的首要因素。3）在37 ℃贮藏条件下，W样中的总酚质量浓度对褐变度起首要作用，也是其褐变度的第一决定因素；对于D样来说，VC质量浓度对褐变度起首要作用，VC质量浓度和5-HMF质量浓度的交互作用是褐变度的第一决定因素。综上所述，可以通过控制多酚和VC的损失，以及阻止5-HMF的形成来防止余甘子果汁在贮藏过程中的褐变，保护其产品的品质。