裸燕麦球蛋白源多肽对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力的影响

付 媛，张美莉，高韶辉，张 宇

（1.内蒙古农业大学理学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

衰老是一个复杂的自然过程，是所有生物的共同特征。关于衰老的自由基学说是由英国人Harman[1]于1956年提出的。该学说认为，自由基对生物体内的大分子会产生极大的危害作用。随着年龄的增长，抗氧化酶类活性下降，使体内消除自由基的能力下降，体内过量的自由基就会引起脂质过氧化，损伤生物膜，导致细胞代谢紊乱，以致机体多器官、多系统的功能减退，进而导致疾病和衰老[2-3]。目前，清除生物体内过量的自由基已成为抗氧化研究的核心，而天然抗氧化剂以其安全、高效的特点，正引起广大学者的关注。

裸燕麦又称莜麦[4]，在我国高寒地区粮食生产中占有重要地位[5]。裸燕麦是世界公认营养价值很高的粮种之一，其富含蛋白质、不饱和脂肪酸、膳食纤维、维生素、矿物质等营养成分[6]。近年来，对于燕麦蛋白来源的抗氧化剂——燕麦肽的研究报道增多。蔺瑞等[7]通过Osborne法制得裸燕麦球蛋白，并利用盐析、SephadexG-100凝胶层析、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对其进一步纯化，得到了分子质量分别为4.4×104、3.4×104～2.9×104、2.5×104Da的组分，并测得其对O2-·、·OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力都较强，尤其对O2-·的清除能力大于VC，显示较高的抗氧化能力。庞小一等[8]利用碱性蛋白酶水解燕麦，再通过超滤分离，得到分子质量小于5.0×103Da的燕麦肽，测得其对DPPH自由基清除率达80.11%。张美莉等[9]利用碱性蛋白酶对裸燕麦球蛋白进行酶解，分别得到分子质量为1.07×104～1.34×105Da的组分I和分子质量为114～861 Da的组分II，并且测得这两种组分对O2-·、·OH、DPPH自由基都具有非常强的清除能力。任清等[10]通过酶膜反应器利用Alcalase酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽，测得其对DPPH自由基清除率可达57.39%。徐建国等[11-12]制备燕麦抗氧化肽，并测定其对DPPH、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸阳离子自由基都具有清除作用；同时发现燕麦发芽过程中，燕麦肽含量及其抗氧化性均呈增加的趋势。马萨日娜等[13]将裸燕麦谷蛋白水解物经过超滤处理后，获得5 个分子质量肽段的组分。再通过强酸型阳离子树脂732对分子质量大于3.0×104Da肽段进行分离得到组分D，结果显示其清除·OH的能力非常强（半数清除质量浓度为1.532 mg/mL）。由此可见，裸燕麦蛋白源多肽的体外抗氧化能力非常强，但是，其对机体内的抗氧化能力报道得很少。本实验以D-gal致衰老小鼠为模型，研究裸燕麦球蛋白源多肽（peptide from naked oat globulin，PNOG）在机体内的抗氧化能力及其对机体衰老进程的影响，以期为燕麦产品的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裸燕麦，产自内蒙古武川县，晒干、粉碎、过60 目筛，备用。健康昆明种小白鼠，雄性，体质量（20±2）g，购自内蒙古大学实验动物部，生产许可证号：SCXK（蒙）2016-0001。

D-半乳糖（D-galactose，D-gal） 美国Sigma公司；碱性蛋白酶（200 000 U/g） 英国BDH Chemicals公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、单胺氧化酶试剂盒、总蛋白定量测试盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

SQP型万分之一分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司；DZ-1BCII真空干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；SCIENTZ-12N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；L6S紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；Epoch2多功能微孔板检测仪 美国BioTek公司；H2500R-2高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PNOG的制备

按本实验室前期研究方法[9]制备燕麦多肽：裸燕麦粉经石油醚脱脂、10 g/100 mL NaCl溶液提取，在碱性蛋白酶（酶用量10 000 U/g）、底物质量浓度5 g/100 mL、温度60 ℃、pH 9.0条件下水解3 h，制得PNOG，冷冻干燥，备用。

1.3.2 实验动物分组及处理

昆明种健康小鼠60 只，适应性喂养一周后，随机分为6 组：正常对照组，衰老模型组，PNOG低、中、高剂量治疗组，VC阳性对照组。除正常对照组外，其他各组按120 mg/（kg mb·d）颈背部皮下注射D-gal，正常对照组注射等量生理盐水；PNOG低、中、高剂量治疗组每日分别灌胃PNOG 200、600、1 000 mg/（kg mb·d），VC阳性对照组每日灌胃100 mg/（kg mb·d）。每日定时灌胃、注射一次，连续6 周，期间自由饮食饮水，观察小鼠体征表现，每周称量体质量一次[14-16]。

1.3.3 生化指标的测定

末次给药后禁食12 h，眼眶取血，断颈处死，解剖小鼠，迅速取出肝、脑，用4 ℃生理盐水冲洗表面残血，滤纸吸干水分。脏器指数按下式计算。

小鼠血样于4 ℃冰箱放置12 h，3 000 r/min离心20 min，取血清，检测血清中SOD、GSH-Px及CAT的活性。分别取0.2 g肝、脑组织，剪碎后冰浴上匀浆，加入9 倍体积预冷生理盐水配制成10%的组织匀浆液，6 000 r/min低温离心10 min，取上清液测定小鼠各组织测定GSH-Px活性、单胺氧化酶-B（monoamine oxidase B，MAO-B）活性、MDA含量。

血清、肝、脑组织中血清中SOD、GSH-Px、CAT、MAO-B活性，MDA含量以及肝、脑组织的总蛋白含量均按试剂盒说明书测定。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 20.0软件对结果进行t检验统计学处理，测定结果数据均用±s表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠的一般行为学观察

衰老模型组连续皮下注射D-gal 3 周后，毛色逐渐变得没有光泽且易脱落，皮肤变粗糙、没有弹性，尾部出现斑点，精神状态变得倦怠，体型变瘦，体质量增加缓慢，呈现出明显衰老体征。由表1可见，各组小鼠初始体质量基本一致，无统计学差异；而最终体质量中，衰老模型组小鼠体质量极显著低于正常对照组（P＜0.01），从体质量增加值也可以看出，衰老模型组体质量增长极显著低于正常对照组（P＜0.01），表明建模成功。灌胃PNOG后，与衰老模型组相比，体质量增量都明显加快，中、高剂量组呈现出极显著差异（P＜0.01），低剂量组呈现出显著差异（P＜0.05）。VC阳性对照组与衰老模型组相比体质量增量也极显著提高（P＜0.01）。说明灌胃PNOG可提高衰老小鼠体质量。李薇等[17]报道的灌胃石榴籽油能显著增加D-gal衰老小鼠体质量，这与本实验结果一致。

表1 PNOG小鼠体质量的影响（n＝10）Table 1 Effect of PNOG on body mass in aging mice (n= 10)

2.2 小鼠脏器指数测定结果

表2 PNOG对小鼠脏器指数的影响（n＝10）Table 2 Effect of PNOG on organ indexes in aging mice (n= 10)

从表2可以看出，衰老模型组的肝、脑组织的脏器指数明显低于正常对照组，呈极显著差异（P＜0.01），说明建立小鼠衰老模型成功。灌胃PNOG后，中、高剂量组的脏器指数均显著提高（P＜0.05）。表明PNOG具有较好的拮抗肝萎缩和脑萎缩的作用。史珅等[18]研究发现用苹果多酚灌胃后，小鼠肝、脑指数明显高于衰老模型组，与本实验的结果一致。

2.3 PNOG对小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活力的影响

研究表明，人体内存在清除自由基的防御系统，包括SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶系。SOD通过催化O2-·歧化为H2O和O2，来抑制和阻断自由基反应，降低自由基代谢产物的生成[19-21]。GSH-Px能特异地催化还原型谷胱甘肽（L-glutathione，GSH）过氧化物的还原反应，它虽然不直接清除自由基，但是可以阻断由过氧化物引发的自由基对机体的损害，保护细胞膜免受过氧化物的损伤[20-21]。CAT虽不能直接清除·OH，但可以降低·OH的前体——H2O2的浓度，从而起到延缓衰老的作用[22]。SOD和GSH-Px联合作用可有效防止组织细胞过氧化损伤。GSH-Px亦可与CAT协同作用，催化对生物体有害的H2O2的分解，以减少自由基和过氧化脂质的形成。

表3 PNOG对小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活力的影响（n＝10）Table 3 Effect of PNOG on SOD, GSH-Px and CAT activities in serum of aging mice (n= 10)

由表3可知，与正常对照组相比，衰老模型组血清中SOD、GSH-Px及CAT活力均极显著降低（P＜0.01）。灌胃PNOG后，血清中SOD、GSH-Px及CAT活力均显著提高，与衰老模型组相比，中、高剂量组呈现出极显著差异（P＜0.01）。VC阳性对照组血清中SOD、GSH-Px及CAT活力与衰老模型组相比也极显著升高（P＜0.01）。表明PNOG可提高衰老小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活力，提高小鼠的抗氧化能力。研究表明，当机体遭受自由基攻击而被氧化时，外加抗氧化剂可使机体内抗氧化酶类活性得到提高[23-24]。冯沼润等[25]研究显示，灌胃天葵子水煎剂可显著提高D-gal致衰老小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活性，这与本实验结果一致。

2.4 PNOG对小鼠肝组织中GSH-Px、MAO-B活力以及MDA含量的影响

MAO-B存在于神经胶质细胞内，是催化单胺氧化脱氨反应的酶。随着年龄的增长，MAO-B的活力不断增加，因此MAO-B活力的增加是衰老的一个重要指标[26]。MDA含量可直接反映组织细胞脂质过氧化的速率和强度，间接反映细胞的损伤程度，其越高，生物膜破坏越严重[27]。

从表4可以看出，与正常对照组相比，衰老模型组肝组织中GSH-Px活力极显著降低、MAO-B活力及MDA含量极显著升高（P＜0.01）。灌胃PNOG后，肝组织中GSH-Px活力显著升高，与衰老模型组相比，中、高剂量组呈现出极显著差异；MAO-B活力极显著降低；高剂量组MDA含量呈现出极显著降低（P＜0.01）。VC阳性对照组与衰老模型组比较，肝组织中GSH-Px活力极显著升高，MAO-B活力及MDA含量极显著降低（P＜0.01）。表明PNOG可提高衰老小鼠肝组织中GSH-Px活力、降低MAO-B活力及MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力。

表4 PNOG对小鼠肝组织中GSH-Px、MAO-B活力及MDA含量的影响（n＝10）Table 4 Effect of PNOG on GSH-Px and MAO-B activities and MDA content in liver tissue of aging mice (n= 10)

2.5 PNOG对小鼠脑组织中GSH-Px、MAO-B活性以及MDA含量的影响

表5 裸燕麦球蛋白源多肽对小鼠脑组织中GSH-Px、MAO-B活力及MDA含量的影响（n＝10）Table 5 Effect of PNOG on GSH-Px and MAO-B activities and MDA content in brain tissue of aging mice (n= 10)

由表5可以看出，与正常对照组相比，衰老模型组脑组织中GSH-Px活力极显著降低、MAO-B活力及MDA含量极显著升高（P＜0.01）。灌胃PNOG后，脑组织中GSH-Px活力显著升高，与衰老模型组相比，中、高剂量组呈现出极显著差异（P＜0.01），低剂量组差异显著（P＜0.05）；MAO-B活力极显著降低（P＜0.01），并且随着灌胃剂量的增加，MAO-B活力与衰老模型组差异逐渐增大；MDA含量也呈下降趋势，高剂量组呈现出极显著差异（P＜0.01），中剂量组呈现出显著差异（P＜0.05）。VC阳性对照组脑组织中GSH-Px活力显著升高、MAO-B活力及MDA含量显著降低，与衰老模型组比较，呈极显著差异（P＜0.01）。表明PNOG可提高衰老小鼠脑组织中GSH-Px活力、降低MAO-B活力及MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力。马蕾等[28]报道，灌胃蔷薇红景天原花青素可显著提高D-gal致衰老小鼠肝、脑组织中GSH-Px活力，显著降低MAO-B活力及MDA含量，这与本实验结果一致。

3 结 论

PNOG可以有效提高D-gal致衰老小鼠体质量及脏器指数，增强小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT的活性，增强肝、脑组织中GSH-Px活性，降低肝、脑组织中MAO-B活性以及MDA含量，表明PNOG可清除衰老小鼠体内过多的自由基，减少其对机体的损害，灌胃600～1 000 mg/（kg mb·d）PNOG与灌胃100 mg/（kg mb·d）VC的作用相当。提示PNOG具有较强的清除体内自由基的作用。