基于陶瓷膜技术的羊乳酪蛋白和其他组分的高效分级分离

姜竹茂，杨宝雨,，芦 晶，逄晓阳，吴 政，岳元春，王 童，Eman Saad RAGAB，张书文,，吕加平,

（1.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264000；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

羊乳具有“奶白金”的美誉，营养价值丰富，组分接近于母乳，且易于消化吸收[1-2]，不易发生乳糖不耐症和过敏反应等特点[3-4]，是开发婴幼儿配方奶粉的良好原料[5]。羊乳中主要有酪蛋白和乳清蛋白两种，酪蛋白分子质量明显大于乳清蛋白[6]，基于此特点，可利用膜分离技术对鲜羊乳进行高效的分级分离，生产出羊乳全乳蛋白、酪蛋白、乳清粉、脱盐乳清粉等不同类型的乳蛋白类产品。

膜分离技术是一种高效、纯粹的物理分离过程，与蒸发、冷冻相比能耗较低，生产过程中不需添加任何化学物质，而且操作温度低，特别适合于对热敏物质的处理[7]。利用膜分离生产的乳清粉变性程度低，酪蛋白胶束粉的天然胶束结构不会被破坏。膜分离技术制备的羊乳清粉具有较好的营养价值和优异的功能特性，可广泛应用于婴幼儿配方乳粉、功能性食品、特医食品等产品中[8]。

国内，陈建行等[9]通过膜分离建立了牛乳酪蛋白胶束粉的生产工艺；张瑞华等[10]通过膜分离对牛乳酪蛋白胶束粉进行了超声改性研究，提高了酪蛋白胶束粉的溶解度；李俊柯等[11]通过低温微滤制备了新型功能性牛乳蛋白配料。Karasu等[12]对比分析了陶瓷膜和卷式有机膜分离脱脂乳，发现陶瓷膜更适合大规模工业化生产；Jørgensen等[5]优化了微滤过程中的温度和陶瓷膜的孔径；Hurt等[13]在50 ℃条件下，通过恒压微滤进行酪蛋白胶束浓缩，发现乳清蛋白脱除率可达98.3%，但关于羊乳的膜分离技术研究报道较少。

以脱脂羊乳为原料，利用膜技术进行高效分级分离，渗透液用来生产高品质的乳清蛋白产品，截留液可以直接用于干酪或酪蛋白胶束粉的生产，与传统分离蛋白质的方法相比，既提升质量、效率，又减少了环境的污染。本研究通过建立一个多阶段微滤过程，对脱脂羊乳中的酪蛋白和其他组分进行分离，以期为羊乳基料的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料羊乳40 kg，采集于北京海淀区。

硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、盐酸、硝酸、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；30%过氧化氢（优级纯）、调谐溶液、多元素校准标样 美国Agilent公司；乙醇北京化工厂；8%～16%梯度胶、eStainL1染色液、eStainL1脱色液 南京金斯瑞有限公司；宽范围彩色预染蛋白质Marker（MP206） 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

图1 陶瓷膜中试设备Fig. 1 Schematic diagram of pilot-scale ceramic membrane microfiltration

表1 微滤陶瓷膜相关信息Table 1 Operating parameters of ceramic membrane microfiltration

PT-20TS LAB杀菌机 日本东京Powerpoint International有限公司；FT15-A碟片式离心机 英国Armfield公司；陶瓷膜中试设备（图1）、0.05 μm孔径管式陶瓷膜（表1） 上海凯鑫分离技术有限公司；2300全自动微量凯氏定氮仪 丹麦FOSS集团有限公司；基础电泳仪电源、Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽美国Bio-Rad公司；Perfection V39扫描仪 日本Epson公司；DIgieye DigitalImaging System型电子眼英国Verivide公司；HI2214 pH计 意大利HANNA有限公司；MARS5密闭微波消解仪 美国CEM公司；7700X电感耦合等离子体色谱仪 美国Agilent公司；ZLS-4真空低温离心浓缩仪 湖南赫西仪器装备有限公司；ICS-3000离子色谱仪 美国Dionex公司；30 L小型浓缩机 北京奈诺科技有限公司；Mobile Minor型喷雾干燥机 德国GEA Nior公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂乳微滤操作工艺

1.3.2 膜通量、浓缩倍数和脱除率的计算

膜通量根据公式（1）[14]计算。

式中：J代表膜通量/（L/（m2·h））；60 代表每小时的分钟数/（min/h）；m为一定时间内所得渗透液的质量/kg；A代表膜面积/m2；t为时间/min。

浓缩倍数计算如式（2）所示。

式中：m脱脂乳为脱脂乳的质量/kg；m透过液为浓缩到某一时刻透过液的质量/kg。

膜对物质A（乳清蛋白、乳糖、灰分或矿物质）脱除率的计算如式（3）所示。

式中：m1指渗透液中物质A的质量/kg；m2指脱脂乳中物质A的质量/kg。

1.3.3 料液成分分析

采用凯氏定氮的方法，分别测定脱脂乳、各阶段截留液和渗透液中的总氮、非蛋白氮、非酪蛋白氮含量，其中总氮含量采用AOAC 991.20;33.2.11的方法测定；非蛋白氮含量采用AOAC 991.21;33.2.12方法测定；非酪蛋白氮含量的测定采用AOAC 998.05;33.2.64方法测定。各蛋白含量计算如式（4）～（8）所示。

另外固形物含量根据（AOAC 990.20;33.2.44）方法测定，灰分质量分数按照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》方法测定，pH值使用pH计直接测定。

1.3.4 颜色分析

采用电子眼来测定脱脂乳、各阶段截留液与透过液溶液颜色的变化，仪器使用前先用白板和标准色卡对相机进行白平衡和颜色校正。将样品置于室温下，分别测定各样品的L*、a*和b*值。

1.3.5 乳糖分析

参考文献[15]的方法并稍加修改。向样品中加入两倍体积的4 ℃乙醇，将溶液在5 ℃、4 000×g下离心30 min进行蛋白质脱除。收集上清液，并在48 ℃下通过真空低温浓缩除去乙醇，最后用超纯水定容至原体积。测定采用离子色谱法，Carbo PacTMPA20糖分离柱（3×150 mm）；流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；流动相A：超纯水，流动相B：250 mmol/L NaOH，检测器：脉冲安培检测器，金电极。梯度洗脱条件：0～40 min，92.8%超纯水；40～40.1 min，仪器按照程序设定的梯度自动线性变化；40.1 min超纯水降至0%，氢氧化钠增加到100%；维持上述比例至45 min；45.1～55 min仪器按照程序设定的梯度自动线性变化至初始条件。

1.3.6 矿物质分析

采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）仪进行检测。仪器工作条件：射频功率：1 280 W；雾化室温：2 ℃；采样深度：8 mm；冷却器流速：1.47 L/min，载气流速：1 L/min。

1.3.7 SDS-PAGE分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）判定各阶段截留液和滤过液中蛋白种类和大致含量。梯度胶的质量分数为8%～16%，其中脱脂乳稀释15 倍，截留液均稀释50 倍，渗透液均稀释2 倍，与2×样品缓冲液（体积比1∶1）于微量离心管中混合，置于沸水浴中加热5 min，2 000 r/min离心10 min，取10 μL上样，电泳结束后，将凝胶置于eStain L1蛋白染色仪中染色3.5 min，脱色2 次，分别是1.5 min和3 min，取出并扫描分析。

1.3.8 毛细管电泳分析

参考文献[16]的方法，采用毛细管电泳相对定量分析脱脂羊乳与透过液的乳清蛋白含量。将样品与样品缓冲溶液按体积比1∶1混合，室温放置1 h，10 000 r/min离心，取上清液，用0.45 μm的滤膜过滤后直接进样。其操作条件为分离电压20 kV、柱温38 ℃、进样压力0.5 psi、时间5 s、紫外检测波长214 nm。样品缓冲液：0.295 4 g柠檬酸钠、0.156 g二硫代苏糖醇、2.011 1 g三羟甲基胺基甲烷，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，用1 mol/L氢氧化钠溶液调至pH值为8.0。运行缓冲液：4.208 3 g柠檬酸、0.582 8 g柠檬酸钠、0.05 g羟丙基甲基纤维素，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，用磷酸溶液调至pH值为3.0。

1.3.9 膜的污染程度与清洗效果分析

膜的污染程度使用纯水通量衰减系数（公式（9））来衡量，其值越大表示膜污染越严重[17]。

式中：J0和Jt分别为过滤前和过滤结束后仅用水清洗1 次后膜的纯水通量/（L/（m2·h））。

膜的清洗效果可采用纯水通量恢复系数（公式（10））来表示[17]。

式中：J0和JQ分别表示膜过滤前和清洗后的纯水通量/（L/（m2·h））。

1.4 数据处理

各实验均重复进行3 次，结果表示为 ±s。实验数据采用SPSS18.5和Origin Pro 9.1软件进行统计处理与作图分析。采用方差分析法进行差异显著性比较，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 膜通量的变化

脱脂羊乳酪蛋白和乳清蛋白的粒径大约为188.5 nm和10.1 nm，因此根据直径的不同将乳清蛋白和酪蛋白分开是可行的[18]。国际上一般选用0.1 µm陶瓷膜分离脱脂牛乳。本研究的预实验表明，0.05 µm陶瓷膜分离脱脂羊乳的效果优于0.1 µm。故选用0.05 µm陶瓷膜，通过热交换使料液温度保持在50 ℃，调节进、出口阀门，使三个阶段进口压力保持在0.18 MPa，出口压力保持在0.08 MPa，压差△P＝0.1 MPa，错流速率46 L/h的条件下，阶段1、2和3的膜分离时间分别是16、16.5 min和16.65 min，膜通量基本维持在79.74 L/（m2·h）。Zulewska等[19]使用0.1 µm恒压陶瓷膜、0.1 µm梯度陶瓷膜和0.3 µm卷式有机膜将脱脂牛乳直接浓缩3 倍，研究结果发现膜通量分别为54.08、71.79 L/（m2·h）和16.21 L/（m2·h）。Adamas等[20]使用0.14 µm Isoflux陶瓷膜将脱脂牛乳进行3 倍浓缩、2 次清洗过滤，平均膜通量为55 L/（m2·h）。羊乳的微滤很少有文献报道，本研究结果表明，羊乳的微滤膜通量明显高于牛乳，工业化分离羊乳酪蛋白和其他组分具有一定的可行性。由图2可知，随着时间的延长各阶段膜通量不断下降（P＜0.05），这是由于截留液不断浓缩，脱脂羊乳的固形物含量和黏度不断增大，导致在膜表面的剪切力变小，浓差极化作用增大，陶瓷膜受到一定程度的污染，影响了可透过成分的渗透[21]。阶段2、3初始膜通量小于阶段1初始膜通量，阶段2、3初始膜通量无显著变化（P＞0.05），这是因为在第1阶段过滤后膜污染已经形成，之后的加水稀释过程并没有有效消除膜污染[22]。

图2 稀释过滤过程中膜通量随时间的变化Fig. 2 Changes in membrane flux during microfiltration of skim milk and diluted fractions

2.2 料液组成成分的变化

原料乳和巴氏杀菌脱脂乳的物理组成如表2所示。羊乳一般在加热过程中会造成β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，Lg）和κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN）形成分子间二硫键，造成乳清蛋白变性[23]。为了达到巴氏杀菌的条件，并减小乳清蛋白的热变性，采用较低的温度和较短的时间进行杀菌（72 ℃、15 s）。在微滤之前，β-Lg和κ-CN的过度热结合可能降低膜分离乳清蛋白和酪蛋白的能力。因此在巴氏杀菌前后测定酪蛋白和真蛋白的比例是检测乳清蛋白变性程度的重要指标。从表2中可以看出，巴氏杀菌前后的酪蛋白/真蛋白值（79.50%、78.72%）无显著性差异（P＞0.05）。Beckman等[24]报道了将杀菌条件从72 ℃、16 s变为79 ℃、18 s，酪蛋白/真蛋白值提高了1.8%。虽然提高了2 ℃、2 s，但是也会导致乳清蛋白产生较大的变性，并减少可通过微滤去除的乳清蛋白。用凯氏定氮分析时，也会导致对羊乳中酪蛋白含量的高估[25]。

各阶段截留液中各组分含量的变化如表3所述，可以看出各阶段截留液酪蛋白、脂肪含量无显著性差异（P＞0.05），因为稀释倍数和浓缩倍数是相同的，且羊乳脂肪球平均粒径为3.55 µm，进一步说明0.05 µm陶瓷膜可以将酪蛋白、脂肪有效截留。但是各阶段截留液固形物、粗蛋白、非蛋白氮、非酪蛋白氮、真蛋白和乳清蛋白含量不断降低（P＜0.05），这是因为随着稀释过滤的进行，截留液中乳糖、乳清蛋白、小分子氮化合物和矿物质不断透过膜。另外，当非酪蛋白氮按照1.3.3节的方法前处理后，样品的澄清度低，这表明用于截留液中的缓冲液容量不足以使微滤截留液的pH值降到4.6（酪蛋白的等电点）。非酪蛋白氮滤液的浑浊表明存在未沉淀的酪蛋白，并高估了非酪蛋白氮值。因此，认为实际酪蛋白和酪蛋白/真蛋白值被低估，实际乳清蛋白值被高估。研究结果与Admsa等[20]报道的相一致。

表3为各阶段透过液中各组分含量的变化，可以看出各阶段透过液固形物、粗蛋白、非蛋白氮、非酪蛋白氮、真蛋白和乳清蛋白的含量随着稀释过滤阶段的增加而不断下降（P＜0.05），这是因为各阶段连续用去离子水进行稀释过滤，各阶段可以透过的物质逐渐减少。在各阶段渗过液中没有酪蛋白和脂肪（P＞0.05），说明该陶瓷膜可以将酪蛋白和脱脂乳中残留的脂肪全部截留。此法生产的天然乳清蛋白脂肪含量较少，可生产出功能性能优于使用奶酪副产物制作而成的乳清蛋白粉，较好地解决了因脂肪存在造成风味缺陷和起泡性不良的问题[26]。

表2 巴氏杀菌脱脂羊乳与原料乳成分对比Table 2 Compositions of pasteurized skim goat milk and raw goat milk

表3 巴氏杀菌脱脂羊乳与各阶段截留液和透过液的成分组成Table 3 Characterization of pasteurized skim goat milk, retentates and permeates from microfiltration of pasteurized skim goat milk

2.3 色度的变化和电泳分析

图3 脱脂羊乳与各阶段截留液及透过液的色度比较Fig. 3 Color of skim goat milk, retentates and permeates

表4 脱脂羊乳、各阶段截留液和透过液色度值Table 4 L*, a* and b* values of skim goat milk, retentates and permeates from each microfiltration stage

图4 脱脂羊乳与各阶段截留液及透过液的SDS-PAGE图Fig. 4 SDS-PAGE of skim milk, retentates and permeates from each microfiltration stage

图5 脱脂羊乳与各阶段透过液的毛细管电泳图Fig. 5 Capillary electrophoresis of skim goat milk and filtrates from each sequential microfiltration stage

酪蛋白胶束和脂肪球的折射率与水的折射率有很大不同，这种差异使胶体微粒均匀反射全波长的可见光，因此，在日光下观察到的牛奶是乳白色[27]。由图3、表4可知，相对于脱脂羊乳，截留液的颜色随着阶段的增加逐渐变白，各阶段截留液L*值、a*值都显著增大（P＜0.05），这与Zulewska等[19]的研究结果相一致，样品开始偏亮、偏红和偏蓝，这是因为截留液的酪蛋白含量显著性高于脱脂羊乳中的酪蛋白含量。透过液颜色逐渐变浅，各阶段的透过液L*值无显著变化，a*和b*值逐渐增大（P＜0.05），这是因为透过液不含有酪蛋白，均澄清透明，不会对明亮值L*产生影响，并且随着补水稀释，核黄素含量逐渐降低。由图4和图5可知，截留液中随着微滤阶段的增加，酪蛋白条带基本没有变化，但乳清蛋白条带逐渐变浅，说明每个阶段逐渐有蛋白脱除。透过液中不含酪蛋白，乳清蛋白条带逐渐变浅，说明每个阶段蛋白的脱除率依次降低，并且0.05 μm陶瓷膜可以对酪蛋白进行有效截留，这与料液组成成分结果相一致。

2.4 pH值的变化

由表5可见，各阶段初始液、截留液、透过液pH值随着微滤阶段的增加不断升高（P＜0.05），这是因为在稀释过滤过程中氢离子和缓冲盐离子不断被去离子水稀释。渗透液的pH值在各阶段之间变化最大，其次是初始液，再次是截留液。这一趋势可以解释为乳清相中可溶性盐不断被稀释，与Adams等[20]的研究结果相一致。

表5 各阶段初始液、截留液和透过液的pH值变化Table 5 pH of skim goat milk, rententates and permeates from each microfiltration stage

2.5 各阶段脱除率的比较

微滤的经济效率取决于乳清蛋白和酪蛋白的分离效率，因此可以用脱脂羊乳中乳清蛋白的脱除率评价膜的性能。如表6所示，随着微滤阶段的增加，乳清蛋白脱除率不断降低（P＜0.05）。越来越少的乳清蛋白穿过陶瓷膜，这与图2的结果相一致。累计脱除率不断增加，说明乳清蛋白不断被分离。为了使乳清蛋白的脱除率达95%以上，Adams等[20]使用0.14 μm Isoflux陶瓷膜6 次洗滤，累计运行12 h；Hurt等[13]使用了0.1 μm的恒压陶瓷膜对脱脂乳进行3 阶段微滤；Beckman等[24]使用了0.3 μm卷式有机膜进行了6 次洗滤，但是这样需要更长的运行时间、更大的膜面积和更多的去离子水。本研究在陶瓷膜不阻挡乳清蛋白穿过的情况下，乳清蛋白的理论累计脱除率为98%，乳清蛋白的脱除率与理论值接近（P＞0.05），说明0.05 μm陶瓷膜对乳清蛋白有较好的分离效果。

如表3所示，除铜外，截留液中其他矿物质含量发生显著性变化（P＜0.05），这一发现可以用α-La和β-Lg具有螯合铜的能力来解释[28]。乳中的无机盐有一部分成结合状态，乳中大约有60%～70%的钙和50%的磷以胶体磷酸钙的形式和酪蛋白胶束结合，不易穿过膜孔，这是造成最后一阶段灰分含量低的主要原因。

表6 各组分各阶段脱除率比较Table 6 Removal percentages of various components at each microfiltration stage%

2.6 膜的污染程度与清洗效果

稀释过滤完毕后对0.05 μm陶瓷膜依次进行水、2%氢氧化钠溶液、1%硝酸溶液清洗，并在操作压力（进口0.18 MPa、出口0.08 MPa）和50 ℃条件下对纯水通量进行测定，结果见表7。根据表7的数据计算得到膜的纯水通量衰减系数为55.57%，可能是脱脂羊乳在膜分离过程中，受到不可逆的膜污染。Zulewska等[19]通过对脱脂乳和超滤液分别进行3 倍微滤，说明小分子的乳清蛋白只会沉积到膜表面或膜孔径中，但酪蛋白会与膜结合形成不可逆沉淀，进一步说明陶瓷膜随微滤时间的延长，膜通量会逐渐降低。纯水清洗后恢复系数仅为44.43%，说明纯水基本起不到清洗效果。经碱溶液清洗后，膜通量恢复至76.03%。再进行酸洗，膜通量恢复系数为99.21%，微滤前和清洗后的膜通量无显著变化（P＜0.05）。说明通过上述清洗方法清洗后，陶瓷膜得到有效恢复。

表7 不同阶段陶瓷膜的纯水通量Table 7 Water membrane flux before ultrafiltration and after each cleaning step

3 结 论

本研究以脱脂羊乳为原料，在50 ℃条件下，对脱脂乳进行3 倍浓缩、3 阶段微滤，发现陶瓷膜的平均膜通量在79.74 L/（m2·h）左右，高于目前报道的牛乳分离效率。从透过液组分、SDS-PAGE和毛细管电泳图可以看出酪蛋白和其他组分得到了有效分离。0.05 μm陶瓷膜乳清蛋白的脱除率为96.17%，乳糖脱除率为86.42%，灰分脱除率为73.39%，钙脱除率为34.90%，磷脱除率为55%，膜通量恢复系数为99.21%。本研究为羊乳的深加工、功能性羊乳基料开发提供了理论和应用参考。功能性乳基配料生产是乳制品开发的核心环节，对于大幅度提高原料乳利用率、提升乳品加工附加值和推动乳业结构转型升级、产品创新开发具有重要作用。