细胞凋亡及与线粒体电压依赖性阴离子通道1的联系在阿尔茨海默病中的研究进展

何佳欢综述，孙晓红审校

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知功能下降和行为能力受损为特征的中枢神经系统退行性疾病。病理特征主要表现为β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成老年斑及微管相关蛋白tau蛋白异常高度磷酸化导致神经原纤维缠结(NFTs)，也包括突触细胞丢失、异常神经元变性坏死等[1,2]。

细胞凋亡主要是一种由基因调控的细胞发生程序化死亡现象，在生物体内细胞凋亡必不可少。胚胎正常发育过程中，生理性细胞凋亡负责清除局部细胞及受损的异常细胞来维持组织细胞稳态。某些病理性因素的影响下，细胞凋亡过程则对生命体有害，导致中枢神经系统退行性疾病的发生[3]。线粒体电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)是一种中枢蛋白，在线粒体外膜(OMM)表达,调节细胞的主要代谢和能量功能。研究证实AD与VDAC1过度表达触发细胞凋亡有关。因此，本文就近年来有关细胞凋亡及与VDAC1的联系在AD中的研究进展进行综述。

1 细胞凋亡的概述

1.1 细胞凋亡的形成 1965年，有研究学者在结扎鼠肝门静脉后发现了一些死亡细胞，它们体积缩小，染色质凝聚，脱落后被巨噬细胞吞噬，但这些死亡细胞溶酶体完好，机体并无任何炎症反应形成，由此，“细胞凋亡”这一现象引发人们关注。细胞凋亡早期，细胞萎缩，细胞质变稠，细胞器堆积紧密，随后细胞发生广泛的质膜起泡，核膜漏出将细胞碎片分离为凋亡小体，随后被巨噬细胞、实质细胞或赘生性细胞吞噬并在吞噬溶酶体内降解[4]。

1.2 细胞凋亡传导通路 由于细胞凋亡启动阶段不同可将细胞凋亡过程分为：线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路、穿孔素/颗粒酶通路。

线粒体通路：线粒体是细胞中的“能量制造工厂”为细胞供应能量，介导细胞内的氧化还原平衡，调节机体钙稳态以及活性氧(ROS)生成，并参与细胞凋亡等众多生理过程。在线粒体通路启动细胞凋亡过程中，促凋亡蛋白和线粒体外膜或胞浆中抗凋亡蛋白Bcl-2作用，拮抗Bcl-2抗凋亡功能，促进线粒体外膜渗透(MOMP)，MOMP导致细胞色素C(Cyt-c)、线粒体胱天蛋白酶(caspases)激活剂(Smac)和细胞凋亡诱导因子(AIF)从线粒体内释放，引起细胞凋亡。Cyt-c在细胞膜迅速释放与细胞凋亡相关因子(APAF1)结合，APAF1寡聚形成凋亡小体切割procaspase-9以产生活化的caspase-9，后者又激活caspase-3导致DNA断裂。Smac释放到细胞质后与凋亡抑制蛋白(IAPs)结合使IAPs失活，细胞凋亡过程得以顺利进行。AIF锚定于线粒体内膜，被钙依赖性蛋白酶切割后通过核定位信号(Nuclear localization sequence,NLS)转移到细胞核中，诱导DNA片段化和染色质浓缩介导细胞凋亡发生[4～6]。目前，对此通路的调控机制仍未完全明确，线粒体蛋白的释放也成为研究线粒体通路调控细胞凋亡的关键。

死亡受体通路：死亡受体是属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)基因超家族的一种跨膜蛋白，与肿瘤坏死因子配体(TNF)基因超家族的细胞因子相互作用通过募集两种适配器蛋白(TNF受体相关死亡域蛋白TRADD和Fas受体相关死亡域蛋白FADD)来传递死亡信号。TRADD招募FADD引发下游procaspase-8发生自裂，产生活化的caspase-8裂解procaspase-3，产生活化的caspase-3，负责多种细胞内蛋白降解的最终执行。Fas受体与FADD和procaspase-8形成诱导细胞死亡的信号复合物(death-inducing signaling complex,DISC)，产生的caspase-8能够有效裂解Bcl-2家族成员Bid，产生活性tBid因子激活促凋亡因子Bax,随后Bax与线粒体外膜互相结合，通过线粒体途径诱导细胞凋亡[4]。可见线粒体通路与死亡受体通路相互联系共同推动细胞凋亡过程的发生。

内质网通路:内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是细胞内钙离子的主要“储存库”，它也是一个依赖于蛋白质伴侣的蛋白质质量控制系统。蛋白质伴侣能识别错误折叠的蛋白质，并促进它们正确构象折叠，如果折叠过程失败，错误折叠的蛋白质在ER腔中积累称为“ER应激”。内质网钙离子平衡被破坏或者内质网蛋白质积累会使位于内质网膜上的caspase-12表达，并导致细胞质中的caspase-7转移到内质网表面，激活的caspase-12进一步剪切caspase-3参与细胞凋亡过程[4]。

穿孔素/颗粒酶通路：该通路与T细胞介导的细胞毒性和穿孔素颗粒酶依赖性杀伤细胞有关。分泌跨膜孔形成分子穿孔素，通过孔释放胞质颗粒并进入靶细胞，随后分泌的颗粒酶A或颗粒酶B诱导细胞凋亡。颗粒酶A途径通过损伤单链DNA激活非caspase依赖性细胞凋亡途径，并且通过促进铁硫蛋白裂解使线粒体新陈代谢功能障碍,此过程产生的ROS使SET复合物(SET complex)裂解，释放的脱氧核糖核酸酶Nm23-H1使染色体DNA形成单链DNA裂口引起DNA断裂导致靶细胞凋亡。颗粒酶B可以在靶细胞的天冬氨酸残基上直接切割caspases活化的DNA酶抑制剂(ICAD)激活caspase-10。同时颗粒酶B还可以有效利用线粒体细胞凋亡途径特异性裂解Bid，并且诱导细胞色素大量产生来扩增死亡信号，颗粒酶 B也可以直接与caspase-3作用，使caspase-3激活从而绕过上游信号通路，直接诱导细胞凋亡的执行阶段[7,8]，这说明线粒体途径和caspase-3的直接激活是颗粒酶B诱导杀伤细胞的关键。

2 细胞凋亡与阿尔茨海默病

2.1 细胞凋亡与Aβ Aβ也称β-淀粉样蛋白，它是淀粉样前体蛋白(APP)被β-、γ-蛋白酶分解后断裂形成的一种未知功能的跨膜蛋白，Aβ堆积形成大脑皮质老年斑是AD形成的重要原因，Aβ诱导的神经细胞凋亡也促使AD发生。Aβ消耗内质网中的Ca2+，导致胞质内Ca2+超载，线粒体膜电位降低，Bax向线粒体移位，线粒体DNA氧化损伤，激活线粒体凋亡途径[9]。研究发现在暴露于Aβ的皮质神经元中，活化的JNK是转录因子c-Jun磷酸化和活化的必需条件，而转录因子c-Jun又反过来刺激包括Fas配体在内的多个靶基因的转录，Fas配体与Fas受体结合后caspases活化，最终激活死亡受体凋亡途径导致细胞凋亡[10]。研究表明在线粒体重新定位之前，质膜脂质微区中双唾液酸神经节苷脂(GD3)可在神经酰胺、Fas或TNF-α的促进下快速积累导致Aβ刺激凋亡的发生[11]。此外，Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)通过NF-κB导致NOD(nucleotide binding oligomerization)样受体家族3(NOD-like receptors,NLRP3)上调参与caspase-8凋亡信号转导可能是神经细胞形成的Aβ纤维启动的[12]。 钙调神经磷酸酶1(RCAN1)主要在AD患者海马和皮质神经元中存在，它在原代神经元中过度表达激活caspase-9和caspase-3加剧Aβ诱导的神经细胞凋亡[13]。近年来，细胞凋亡与 Aβ相互作用的调节机制尚未阐明，但调控细胞凋亡的进展也逐渐为AD的潜在治疗方向提供新思路。

2.2 细胞凋亡与tau蛋白 微管相关蛋白tau蛋白过度磷酸化是AD的另一重要病理改变之一。通常微管蛋白支撑着微管的结构，然而致病性tau蛋白与微管分离会损害神经元的细胞骨架，胞质中脱落的tau蛋白容易形成聚集物并进一步发展为NFTs，不能被蛋白酶体系统或自噬系统降解，从而导致神经元缺陷。研究发现tau的磷酸化增加与神经细胞凋亡有关。用 Aβ处理胚胎大鼠海马原代神经细胞，观察到tau磷酸化诱导tau蛋白激酶I(TPKI)增加，破坏了轴突运输最终导致细胞凋亡。tau可以与突触后致密蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)和非受体酪氨酸激酶Fyn相互作用，稳定突触后的N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体，延长NMDA受体激活可能导致大量Ca2+通过同一受体流入，从而使钙蛋白酶激活和线粒体功能障碍，导致细胞凋亡[14]。此外，突变的tau可下调IAPs并激活caspase-3，同时显著增加G2/M期阻滞的神经元数量，这表明突变的tau会使成熟的神经元凋亡或增加它们对细胞凋亡的敏感性。另一项研究发现，tau中几个特定残基的磷酸化会导致细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)上调，为tau磷酸化状态影响细胞凋亡的诱导提供了证据[15]。值得注意的是，与tau磷酸化可以促进聚集形成并增强细胞毒性的普遍观点相反，一些研究表明tau的去磷酸化会加重细胞凋亡，tau的磷酸化反而可以保护神经细胞免于凋亡。tau过度磷酸化竞争性抑制β-连环蛋白(β-catenin)在细胞质中的蛋白水解，细胞质β-catenin增加引起核β-catenin相应增加使生存信号通路激活，从而导致细胞逃脱凋亡[16]。可见，tau和β-catenin的底物竞争性磷酸化使细胞具有抗凋亡作用，tau蛋白在不同残基上磷酸化会对下游信号产生多样化影响，可能改变细胞凋亡的途径。总之，细胞凋亡与tau蛋白之间的相关机制十分复杂，还需进一步深入探讨。

2.3 细胞凋亡与VDAC1 VDAC1是一种多功能蛋白，在所有真核生物的线粒体外膜(OMM)上表达。三维结构显示它由19个跨膜β链组成，通过柔性环连接形成一个β链，在孔内有一25个残基长的N端结构域。该蛋白调节细胞的主要代谢和能量功能，包括钙稳态、氧化应激和线粒体介导的细胞凋亡。VDAC1作为线粒体介导细胞凋亡的关键蛋白，参与线粒体促凋亡蛋白从膜间隔(intermembrane space,IMS)向胞浆的释放过程，并与凋亡调控因子如Bcl-2、Bcl-XL和己糖激酶(hexokinase,HK)相互作用。当存在凋亡诱导信号时，VDAC1以寡聚体结构组装，形成足够大的通道以供Cyt-c通过导致细胞凋亡。另外研究证明，即使没有任何凋亡刺激，VDAC1过度表达也会形成寡聚体并促进凋亡，说明VDAC1在单体和低聚物状态之间动态平衡的改变诱导了细胞凋亡发生。最近的证据表明VDAC1在AD发病机制中具有重要作用，如在AD转基因小鼠的海马提取物中观察到磷酸化VDAC1显着增加,在AD患者大脑中也发现VDAC1过表达[17,18]。研究证实Aβ和VDAC1表达水平之间存在直接联系，由于VDAC1的寡聚作用会触发细胞凋亡，因此VDAC1在受AD影响的大脑中过表达可能与神经细胞凋亡有关[19]。有学者发现在某些疾病中糖原合酶激酶3(GSK3β)活性升高导致异常APP生成，从而增加Aβ产生和tau过度磷酸化，GSK3β使VDAC1在苏氨酸51上磷酸化，导致HK从VDAC1中分离改变细胞代谢，从VDAC1分离后HK无法获得线粒体ATP，减少了糖酵解和葡萄糖代谢所需的ATP供应，并使细胞易于凋亡[20,21]。因此，干扰VDAC1的寡聚可能为治疗与VDAC1过表达相关的AD等疾病提供一种新的治疗策略。

3 小结与展望

综上所述，细胞凋亡在生物体内意义重大，而神经细胞异常凋亡与AD的发生发展密切相关，它在Aβ及tau 蛋白代谢过程中充当关键角色，同时也与导致细胞凋亡的重要调节蛋白VDAC1存在紧密联系。但是细胞凋亡与AD之间的调控机制十分复杂，仍有待广泛深入研究。可见，未来通过调控细胞凋亡及与VDAC1的相关作用作为AD的潜在治疗靶点具有良好的前景。