piRNA与心脏相关疾病研究进展

王 凯，周露玙，刘 靖，王 涛，高向前，王 昆

心血管疾病日益危害人类的生命健康，在心血管疾病方面进行生命科学基础研究对人类社会的生存与发展都有着重大而深远的意义。2006年，多个实验室先后发现一新型非编码小RNA，这种RNA在生殖细胞中表达量较高，一般为25～35 nt，5′端首位通常为单磷酸的尿嘧啶核糖核酸，3′末端一般有甲基化修饰，与Piwi蛋白能结合形成复合体[1]，因此称其为Piwi蛋白互作RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)。随后piRNA逐渐成为非编码RNA领域的研究热点，研究者们在果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠等模式动物的研究中发现，piRNA在生殖细胞以及干细胞分化、胚胎发育、种系DNA的完整性、生物性别决定、免疫防御及癌症预测等方面都扮演着不可或缺的角色[2]。虽然非编码RNA，尤其是piRNA在心血管疾病研究中还处于起步阶段，但是从一些相关研究中可以窥探到piRNA潜在研究价值。作者对piRNA及其与心脏相关疾病的潜在调控关系作一综述。

1 piRNA

1.1 piRNA的发现 20世纪90年代末，干扰RNA(RNA interference，RNAi)被发现，它让人们对基因表达调控方式的理解产生巨大改变。这些非编码RNA不会被翻译成蛋白质，而是通过与靶向RNA互补碱基的配对或与靶向蛋白结合而发挥作用。根据它们加工机制或伴侣Argonaute蛋白的不同，这些小RNA可以分为miRNAs、小干扰RNA(small RNAs，siRNAs)和piRNAs。2006年，Aravin等[3]以3月龄C57小鼠为研究对象，从输精管中分离得到一种小RNA，并发现此高表达小RNA与MILI(一种Piwi亚蛋白)存在相互作用，他们将其命名为piRNA。之后，在对piRNA生物合成的研究中发现，基因间区大量piRNA簇经双向或单向转录形成piRNA前体，再由内切酶剪切产生piRNA；此外，在mRNA 3′端非编码区及基因组中某些长的非编码区域也可产生piRNA[4]。

1.2 piRNA的生物合成 新生piRNA常被运至核外，在胞质被加工成熟，然后再发挥其生物学功能。piRNA产生机制分为初级piRNA途径和次级piRNA途径，主要围绕Slicer活性剪切的“乒乓”扩增循环过程。完成piRNA的成熟加工后[4-5]，在对piRNA“乒乓”循环的深入与细化研究发现除动物的生殖细胞外，体细胞中也存在piRNA合成途径，且生殖细胞和体细胞中piRNA“乒乓”扩增过程存在一定差异。piRNA体细胞途径可直接依赖Piwi蛋白和piRNA簇Fla-menco片段产生piRNA，以转座子为靶标合成piRNA，首先piRNA前体与细胞器Yb小体结合，在Zuc及辅助因子(Vret、Mino、Gasz等)作用下形成中间体piRNA的5′U位点，再产生piRNA次级结构，Zuc对Piwi-piRNA序列剪切形成3′末端，并通过外切酶Trimmer、Papi作用切割Piwi-piRNA成熟位点，接着发生Hen1介导的甲基化，最后成熟的Piwi-piRNA复合物进入细胞核发挥沉默作用，线粒体膜外因子在该途径发挥重要作用[6]。

1.3 piRNA特点 与siRNAs、miRNAs相比，piRNAs的数量较多，约5×104种；它产生不依赖于RNase类核酸酶，长度略大于前2者，一般在24～35 nt范围内；3′端甲基化修饰，5′端第一个核苷酸有尿嘧啶偏向性，且第10位的碱基有腺嘌呤偏向性[7]。小鼠体内piRNA集中分布在X染色体上，Y染色体上分布很少；然而人体内的piRNA绝大多数分布在常染色体上，性染色体上几乎不分布。

1.4 piRNA功能

1.4.1 piRNA参与转录沉默 以往在植物与酵母中研究小RNA介导的转录沉默，认为核Piwi蛋白的存在以及某些piRNA途径突变体中抑制性组蛋白标记或DNA甲基化的种种巧合才使动物中出现Piwi依赖性转录沉默。但随着研究不断进行，已经找到了piRNA途径转座子沉默的直接通路，其中Piwi主要作用于转录水平[8]。这些研究表明成熟的Piwi复合物进入细胞核并扫描可能是新生的转座子产物[9]。在检测之后，通过形成异染色质来强制执行转录抑制。同时猜测piRNA还有抑制外源序列片段插入的功能[10]。

1.4.2 参与表观遗传及生殖系功能调控 Piwi作为表观遗传调控因子，对生殖干细胞正常功能有支持作用[11]。Polycombgroup(PcG)蛋白的存在能维持必要的发育调节因子。果蝇中PcG与PcG反应元件结合可以沉默持家基因，Piwi与PcG蛋白体共定位簇集成PcG反应序列[12]，暗示Piwi相关的piRNA可能参与到表观遗传调控。就RNA积聚而假设的RNA沉默机制研究发现，积聚的RNA包括多种gypsy序列并且沉默效果与卵巢中25～30 nt长度的有义RNA的存在量有关，重复相关小RNA对gypsy转录本有义链具有下调的作用[13]。而且，在雄性生殖系中，Piwi蛋白能够阻止逆转录转座子的转录[14]。这些证据表明某些piRNA可能与后生调控有关。

Miwi，Mili和Miwi 2是Piwi亚家族的3个关键蛋白，特异性存在于生殖系细胞[15]，与精子的发生密切相关，假如敲除Miwi，Mili或Miwi 2基因，都会使小鼠精子出现明显缺陷，通常为雄性不育[16]。敲除Mili，小鼠精子发生过程会停在粗线期；敲除Miwi小鼠的生殖细胞随龄期会有明显损失[15]。Miwi 2突变体中生殖细胞表型与果蝇中Piwi突变体相同，可见两者的Piwi在维持生殖系和干细胞发生时起着相似作用。

1.4.3 维持发育及基因完整性 果蝇中piRNA作用异常会引发DNA损伤信号导致轴线发育特异性缺陷[17]。细胞周期监测点激酶2(checkpoint kinase-2,Chk-2)由基因mnk编码,减数分裂时受损的DNA使Chk-2活化,进而引起特异性发育缺陷，piRNA作用通路异常的后果与DNA修复相关基因突变相似,通过激活Chk-2作用通路产生结果。在果蝇卵子发生时,piRNA通路异常会导致由动力蛋白介导的微管动力复合体聚集[18]，这一过程依赖于Chk-2的激活。Wu等[18]发现DNA损伤时会出现核蛋白聚集体,piRNA产生缺陷使逆转座子RNA水平上调。piRNA缺失时,马达动力蛋白机制使逆转座子RNA运至逆转座子降解位点并在此集结。此外,piRNA在DNA修复过程和维持染色质结构对抗DNA损伤方面或许还应该具有更直接的作用。不仅如此，piRNA在维持mRNA的稳定上也扮演着不可或缺的角色[19]。

1.4.4 piRNA对性别的影响 斑马鱼中有2种Piwi同源蛋白Ziwi和Zili。Ziwi蛋白与小鼠Miwi蛋白同源,Zili蛋白与小鼠Mili蛋白更近似。Ziwi在不同性别间表达存在特异性，Ziwi基因突变会引起生殖细胞凋亡的缺失[20]。而降低Ziwi表达水平雄性生殖细胞依然可以存活到成熟阶段,但成熟后凋亡水平却会显著提升且有多层次的不育症。斑马鱼卵巢中piRNA与其他器官piRNA分子功能相同且多是同源。Ziwi突变会影响斑马鱼性别决定,突变体中只有雄性可以存活[21]。

2 piRNA在心脏生理学和病理生理学中研究进展

2.1 piRNA在心脏组织中的表达 小鼠Piwi蛋白组同源基因Miwi、Mili和Miwi 2分别与人类的Piwil 1、Piwil 2和Piwil 4同源。对于piRNA在体细胞中的表达情况的研究还不甚清楚，Perera等[22]为检测体细胞中piRNA的表达情况，他们对小鼠不同组织中负责合成Piwil 1、Piwil 2和Piwil 4的mRNA的表达水平进行了分析，发现，Piwil 1 mRNA在生殖系(睾丸和卵巢)以及包括大脑、海马和心脏在内的多个体细胞组织中均有表达；在心脏中Piwil 1 mRNA表达水平非常低；而Piwil 2 mRNA表达量相对很高；Piwil 4 mRNA在所有组织中均有表达[22]。由此可见，piRNA与心脏组织有着密切的关系，这也预示着piRNA与心脏相关疾病的研究有巨大潜力。

2.2 piRNA在心脏祖细胞中的潜力 心脏祖细胞，如心脏球、心脏圈衍生细胞，是心脏再生的一种备受关注的细胞来源。但心脏祖细胞的piRNA信号还未被研究。有文献研究表明通过微阵列分析了15 311个piRNAs在心脏球、心脏圈衍生细胞和心脏成纤维细胞中的表达，结果显示一组差异表达的piRNAs(折叠变化≥2，P<0.01)：与心脏圈衍生细胞相比，心脏圈衍生细胞中有641个piRNAs上调，1 301个piRNAs下调，而与心脏成纤维细胞相比，255个和708个piRNA分别上调和下降。还鉴定出181个piRNAs在心脏圈衍生细胞中过度表达，129个piRNA在心脏纤维细胞中下调[23]。piRNAs可能在不久的将来作为心脏相关疾病的一个临床检测靶标。

2.3 piRNA与心肌损伤修复 最近证据表明，piRNA在体细胞中也有表达，包括心肌细胞[24]。有报道称，miRNAs和piRNAs影响Akt信号通路，这是心脏病理生理学中的一个关键网络[25]。因此，piRNAs在心肌细胞的增殖和再生中也可发挥作用。piRNA能够调节转座子的表达和关键分子通路作为Akt信号大量piRNA的表达可诱导Akt活化[25]。Rajan等[26]，研究表明miRNAs和piRNAs都能改变心脏疾病中的Akt通路，Akt是一种存活信号，能促进心肌干细胞和祖细胞增殖和心肌细胞的存活。值得注意的是，许多心脏保护配体-受体系统激活了Akt信号通路，解除对Akt通路管制涉及心脏重塑和得失代偿，从而导致心脏病的发展。Akt信号通路是通过调节线粒体功能和活性氧的产生以及线粒体的能量代谢，从而减少了心脏缺血损伤[27]。这些证据揭示piRNAs在调控心脏生理和病理的网络中起关键作用[28]。

2.4 piRNA与心肌胚层分化 胚胎干细胞具有分化为包括心肌细胞在内的3种胚层细胞的潜力[29]，是帮助理解心脏发育的一个完美模型。Li等[30]使用小RNA深度测序，研究了小鼠心脏分化早期的小RNA组，发现piRNAs在心脏分化过程中也有表达，并列出了分化过程中最丰富的20个piRNAs，给出了规范化读取计数的表达式分析，例如，piR-1078在D0上轻度表达，但在D2上表达增加9倍，并逐渐减少。这些数据表明，piRNA通路可能是控制心肌胚层维持和(或)分化进程的重要调控因子。

2.5 piRNA与心肌肥大、心肌梗死 心肌肥大与心肌梗死在心血管疾病的研究中是必不可少的。有研究者在体内与体外条件下分别诱导的心肌肥厚模型，通过小RNA测序分析[31]，验证了piRNAs的表达，此外通过qPCR和RNA免疫沉淀研究了心肌梗死患者中是否存在piRNAs，结果发现在心肌肥厚过程中，piRNAs表达丰富且发生改变；采用qPCR和RNA免疫沉淀法对差异表达的piRNAs进行了验证，预测大鼠基因组中具有显著差异表达的piRNAs靶标不同的逆转录转座子和mRNA。心肌梗死患者血清中特异性piRNA的检测提示了piRNA的诊断价值。这项研究首次对心脏系统中大量的piRNA进行全基因组分析，为了解piRNA和逆转录转座子在心脏相关疾病分子病因学奠定了新的基础。

3 展望

piRNA是一类新颖且潜力无限的小分子非编码RNA，它种类丰富且杂乱无章，表达随发育阶段不同而改变，不同piRNA表达量间有较大差异。非编码小RNA具有很好的灵活性，它既能以碱基互补配对的方式与DNA结合，又可以通过自身的高级结构(如形成发夹等结构)与蛋白质结合，在基因和蛋白质之间架起一个连接的桥梁。虽然对于临床应用piRNA治疗心脏相关疾病的研究还处于探索阶段，但是已经得到了研究者足够的重视。目前对于piRNA的研究大部分集中在肿瘤领域，但从长远来看piRNA在心脏相关疾病的研究上潜力巨大。