耳蜗毛细胞的细胞电生理实验研究进展

田超永 查定军

中国人民解放军空军军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科全军航空航天医学内耳研究重点实验室（西安 710032）

耳蜗毛细胞（Hair Cells,HCs）位于耳蜗Corti器（螺旋器），能够编码不同频率和强度的声音信号，毛细胞静纤毛弯曲，通过牵拉顶链而产生机械电流，毛细胞去极化释放化学递质进一步兴奋听神经纤维将电信号传至大脑听觉皮层产生听觉应答。因此了解其电生理特性对我们研究生理及病理状态下的耳蜗信息转导很有意义。本文就耳蜗毛细胞的细胞电生理实验现状做一综述。

1 毛细胞的分类

耳蜗HCs分为两种，即内毛细胞（Inner Hair Cell,IHC）和外毛细胞（Outer Hair Cell,OHC）。IHC作为听觉感受器，将声信号传递到中枢神经系统。OHC转导听觉信号，但不能直接将信号传入到大脑，其对声音信号具有放大作用，可使耳蜗对声音频率有高度的敏感性和选择性。

2 毛细胞的离子通道

耳蜗HCs存在多种离子通道，包括钾离子通道、钠离子通道以及钙离子通道及其他离子通道等。在HCs的胞膜上除离子通道外尚存在转运蛋白、动力蛋白以及膜受体等。

2.1 钾通道

目前对内耳HCs钾通道的研究已深入到了分子水平，耳蜗HCs基底部外侧存在KCNQ4、KCNMA1和KCNN2（SK2或小电导钙激活钾通道）钾通道。大量研究表明，大电导钙激活钾通道包括KCNQ4和KCNMA1，二者在离子从HCs到外淋巴转运过程中起重要作用[1,2]。有学者报道，KCNQ4在耳蜗OHC的底部表达[3]，其对听觉功能有重要作用，KCNQ4受体突变与常染色体显性非综合征性耳聋（autosomal dominant non-syndromic hearing loss,ADNSHL-DFNA2A）相关[2,4]，相关研究进一步表明，KCNQ4通道可直接传导OHC钾离子到外淋巴，其突变可导致通道对钾离子的传导和选择性改变。KCNMA1通道为第二个Ca2+激活钾通道，表达于内耳HCs中，二型丝氨酸蛋白酶TMPRSS3的表达行使其功能，但它的复杂作用机制仍未阐明[5]。有学者研究表明，由于KCNMA1通道的广泛表达[6]，TMPRSS3直接影响KCNMA1的功能，所以其对听力的产生具有重要作用。Laurence Molina等也提出TMPRSS3缺失可导致内毛细胞KCNMA1钾通道的表达减少。有研究报道，在鸡的耳蜗中，Slo（kcnma1）基因对耳蜗HCs频率敏感性的确定提供了相关信息。Surguchev等[7]报道蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的增加引起了HCs表面Slo的成簇增加，因此，PKC活性的增加可能促进高频HCs上大量的离子通道聚集。小电导钙激活钾通道KCNN2表达于哺乳动物耳蜗HCs，Tao Yu等[8]研究表明，蜂毒明肽可对其功能产生特异性阻断作用，并且其与nAChRs的α9和α10亚基协同在橄榄耳蜗传出神经支配中产生抑制调控作用[9]。

2.2 钠通道

耳蜗被证实存在许多Na+通道和转运蛋白，包括上皮Na+通道（ENaC）、非选择性阳离子通道、Na+,H+-交换器（NHE-3）、Na+泵（Na+,K+-ATP酶）和Na+,K+,Cl--协同转运蛋白（NKCC1）。Tobias Eckrich[10]等学者研究了耳蜗IHC发育过程中钠离子电流（Na+current,INa）对动作电位的具体作用、通道携带电流的性质和INa在低频和高频IHC中是否具有不同的生理特性。

2.3 钙通道

2.3.1 电压依赖性钙通道

钙结合蛋白2(Ca2+-bingding protein 2,CaBP2)表达在耳蜗HCs，特别是IHC，但在耳蜗螺旋神经元突触后缺少表达。Tobias Mosera等学者提出CaBP2抑制CaV1.3 Ca2+-通道的失活，同时维持CaV1.3 Ca2+-通道作用对突触后声音进行编码[11]。有学者研究的电流结果表明，CaV1.3 Ca2+-通道作为IHC主要的CaV通道有重要的作用。CaV1.3 Ca2+-通道在不同的系统表达符合IHC CaV通道的一系列特征[12]。膜片钳记录和钙成像实验表明，ATP在IHC通过消耗Ca2+-ATP酶避免了胞浆Ca2+增加及钙调蛋白依赖的CaV1.3 Ca2+-通道失活从而维持突触内的Ca2+流入[13]。Philippe F.Y.Vincent等[14]则报道IHCs通过Ca2+胞吐作用使带状突触持续快速的将声音编码为神经冲动，这个突触过程涉及到长和短C-端亚型的CaV1.3 Ca2+-通道，它们在Ca2+依赖性失活和对L-型Ca2+通道阻滞剂硝苯地平的相对敏感性的动力学上是不同的。短C-端亚型对硝苯地平失活快，对硝苯地平敏感性低，其主要控制了易释放池(RRP)的快速融合。长C-端亚型对硝苯地平的失活慢，但对其敏感性却高，主要调节RRP囊泡持续的胞吐。D.Monzani等[15]也报道尼莫地平对L-型钙电流具有选择性阻断作用，所以其在耳蜗的相关通道病治疗中具有重要作用。

2.3.2 受体操纵性钙通道

在内耳，钙离子参与了耳蜗HCs的机械转导、适应、调谐、受体电位的形成和神经递质的释放等多种细胞活动。耳蜗内Ca2+浓度的稳定对正常听觉功能至关重要[16]，目前对受体操纵性钙通道在内耳功能相关研究较少。Xie等报道ACh通过产生第二信使IP3使OHC内Ca2+浓度发生变化，这在维持OHC静息状态下的机械运动和调控OHC电致运动方面发挥重要作用[17]。

2.4 瞬时感受器电位（Transient receptor potential,TRP）通道

TRP通道是一种非选择性阳离子通道，主要通过离子为Ca2+、Na+，但是不同的TRP通道对Ca2+和Na+的选择性存在差异[18,19]。内耳声音的转导依赖于内、外淋巴液中钾离子的循环，TRP通道作用为内淋巴到HCs中钾离子的流入，长期以来一直存在争议，最近研究表明，这些通道属于TRP通道，例如TRPN1、TRPV4、TRPML3、TRPA1[1,2,20]。有研究表明TRP通道在离子流出的起始步骤可能不是唯一的阳离子通道家族。尤其是部分关于大鼠的研究表明，TRP通道家族的基因敲除鼠不能表现出耳聋，表明这些通道在阳离子从内淋巴到HCs起始流入过程中不是唯一的类型[21]。此外，最新的关于离子通道中TRP通道家族作用的研究对每个已知的成员都做了详细的综述。结果表明，基因敲除鼠在信号转导中是充足的。然而，结果同时表明，TRP通道家族不包括信号转导通道[22]。另外一些研究结果表明，TRPC3和TRPC6双基因敲除鼠在听觉和前庭功能中存在明显缺失[23]。TRPC1、TRPC3、TRPC5和TRPC6基因敲除鼠也有明显的增加。这些结果表明，TRP通道家族在内耳功能中有重要作用。然而，阐明TRP通道家族在听觉系统的作用还需要更进一步研究。

2.5 氯离子通道

Gitter等学者用膜片钳技术验证了OHC上存在氯离子通道。正氯离子通道5（Chloride intracellular channel 5 protein，CLIC5）主要集中在 HCs纤毛的底部，其在小鼠的正常听觉和平衡中起作用。Chunhui Gu等[24]报道了MiR-183家族可调控内耳毛细胞CLIC5的表达。Jbg小鼠缺失CLIC5后与RDX,TPRN,PTPRQ和MYO6协同在出生后发育和维持毛束底部膜细胞骨架中起重要作用[25]。

3 Prestin蛋白

2000年，Jing Zheng等[26]首次应用抑制消减杂交PCR法报道prestin蛋白是OHC的动力蛋白，在耳蜗IHC未发现Prestin蛋白表达[27]，它是耳蜗OHC电运动和耳蜗放大效应的分子基础[28]，同时它也是获得性感音神经性耳聋早期诊断的一个生化指标[29]。Prestin有SLC26A蛋白家族的整个结构域[30]，氯离子为其外部电压感受器，可在OHC电位变化时驱动OHC胞体产生电运动。Jinghan Wang等[31]报道Spag6基因敲除小鼠OHC中prestin的表达降低，而Spag6基因在外毛细胞机械感觉功能中发挥主要作用。Harasztosi等[32]将氯离子通道阻断剂蒽甲酸加入到豚鼠耳蜗OHC和经Prestin转染的HEK293细胞内后培养，测量其非线性膜电容（nonlinear capacitance,NLC），两者NLC均呈可逆性、剂量反应关系的下降，在排除PH、细胞骨架的影响后，得出氯离子通道阻断剂可致耳蜗功能改变，且可以调控Prestin蛋白功能的结论。

4 毛细胞EPSCs记录

HCs传入突触的突触抑制作用可能是快速听觉适应的基础，Moser等[33]提出这种听觉快速适应与快速可释放池的耗竭现象相关。Elisabeth和Fuchs[34]第一次用标准的膜片钳方法对传入突触的突触小结进行细胞内记录。电生理研究表明，IHC传入突触的EPSPs由非选择性阳离子通道介导，并且对AMPN受体阻滞剂敏感[35]。Lisa Grant等[36]报道，在IHC带状突触，有两种模式的囊泡释放形成突触后反应，包括单相EPSCs和多相EPSCs，这进一步阐明了听神经纤维的基本特征。Cole W.Graydon等[37]报道，限制突触前体积，带状突触将会为小群的停靠囊泡同步释放创造条件。而Geng-Lin Li等[38]报道，锁相精度能够增强毛细胞带状突触的多量子释放。Jacopo Magistretti等[39]报道Ca2+释放促进谷氨酸在突触末梢的释放，细胞去极化与低中度声音频率同步，HCs递质释放的脉冲导致传入纤维产生EPSCs，从而解释了动作电位活动的锁相模式。Chao-Hua Huang等[40]报道，IHC主要通过胞吐作用释放囊泡，与胞吐速率和囊泡释放的动力学受Ca2+流入调控相一致。

5 毛细胞机械传导

顶链(tip link)结构存在于每一根静纤毛和邻近高他一头的静纤毛之间，其将两根静纤毛连在一起。顶链本身由两个钙黏连蛋白非对称地组成[41]，其上段是CDH23(Cadherin 23)[42]，下端是PCDH15(Protocadherin15)[43]，顶链两端插入静纤毛膜内的部分与若干蛋白形成的结构统称为机械传导复合体。近几年已经鉴定到3个参与该复合体的蛋白。第一个是TMHS，其突变导致严重耳聋[44]；第二个是TMC，其致聋性最早被报道是2002年[45]，2011年研究发现，共敲除TMC1和TMC2可以导致机械电流的完全丧失，显示它们可能作为一个异聚体在机械传导通道复合体中起作用[46]。2014年，熊巍等研究发现，TMIE作为一个二次跨膜蛋白，也参与机械传导复合体[47]。2018年Bifeng Pan等研究人员报道TMC1形成了脊椎动物内耳HCs机械感觉转导通道的孔道[48]。

6 光敏感通道(Channelrhodopsin-2,ChR2)

Bryan D.Monesson-Olson等[49]在毛细胞特殊myo6b启动子对照下应用转基因斑马鱼表达ChR2，然后通过水流机械刺激或用光刺激激活HCs，在体记录斑马鱼侧线的传入神经元。研究人员为进一步明确OHC在耳蜗放大和频率转换中的作用，Wu Tao[50]等应用ChR-2的光遗传学方法，获得了一种OHC生理学或临床研究的操作技术。他们的研究结果表明ChR-2能够成功在小鼠耳蜗OHC表达，并表达典型的光敏感性电流和去极化。随后，Eileen L.Troconis等[51]通过激活内耳和侧线毛细胞ChR-2的表达诱发惊吓反应以及获得头部固定幼鱼高速录像，同时记录场电位。

HCs上还存在许多目前仍未检测到的其他类型的离子通道和转运蛋白，有关HCs的电生理特性还需要进一步研究，这将为我们明确许多遗传性耳聋及其它听力损伤的发病机理，以及探究在细胞和分子水平上由内耳疾病所致的耳聋和听力损伤的诊疗提供新理念、新思路。