检疫性有害生物李痘病毒生物学特性及预防控制技术

王 浩， 万方浩,2， 于 翠， 武 强， 张桂芬,2*

1中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室/农业农村部作物有害生物综合治理重点实验室，北京100193； 2农业农村部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京100193； 3上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135

李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)为马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒组成员，位列造成危害最严重和研究热点的十大植物病毒之一(崔晓艳等,2013)，在核果类果树上引起巨大的损失。该病毒最先在欧洲东部的保加利亚被发现(Atanassov,1932)，并迅速传播至欧洲大部分地区和地中海沿岸区域(OEPP/EPPO,2006)，之后又在南美洲的智利(1992年)(Rosalesetal.,1998)，以及北美洲的美国(1999年)(Levyetal.,2000b; Promed,2006; Snover-Cliftetal.,2007)、加拿大(2000年)(Thompsonetal.,2001)等国家被发现，目前已在56个国家和地区有发生和报道(CABI,2019)。PPV在核果类果树上的危害已引起各国的高度关注，是欧洲和地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO)A2类检疫性有害生物(OEPP/EPPO,2004)，也是加拿大、美国、以色列、阿根廷等国家的限制性有害生物(郑耘等,2009; Lláceretal.,1985; Wetzeletal.,1991a)，2004年中国湖南发现其危害杏树(Navratiletal.,2005)，2007年我国将其列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

PPV毒力强、株系多、危害大、风险高。本文拟从该病毒的生物学特性、传播扩散途径、诊断检测方法及预防控制技术等方面进行阐述，以期为阻止PPV随果树花卉种苗再次传入和进一步传播扩散提供借鉴。

1 生物学特性

1.1 寄主植物

在自然条件下，李痘病毒主要侵染蔷薇科Rosaceae的李属Prunus核果类果树，包括杏P.armeniaca、桃/碧桃P.persica、欧洲李/杏梅P.domestica、李子P.salicina、樱桃李/红叶李P.cerasifera、中国李/日本李子P.salicina及其杂交种，以及甜樱桃/欧洲大樱桃P.avium、山桃P.davidiana、圆叶樱桃P.mahaleb等(Jamesetal.,2013)；亦可偶尔侵染扁桃P.dulcis(Llácer & Cambra,2006)。此外，PPV的其他自然寄主还有刺李/黑刺李P.spinosa、贝西樱桃/西方沙樱桃P.besseyi、毛樱桃P.tomentosa、麦李P.glandulosa、郁李P.japonica、樱桃/野樱桃P.serotina、樱李梅Prunus×blireiana、榆叶梅P.triloba等(James & Thompson,2006)，以及欧洲女贞Ligustrumvulgare和欧洲卫矛Euonymuseuropaea(Polák,2001)等。

1.2 危害症状

李痘病毒可以在寄主植物的花期、果期以及营养生长期侵染，且叶片、枝条、花瓣、果实、树皮及果核均可表现症状(CABI,2019; Cambraetal.,2019)。其中，春季桃树叶片上的症状尤为明显，包括褪绿斑点、条斑或环斑，以及脉明甚至畸形，而且有些桃树品种还会出现断花或破花症状(Barbaetal.,2011)；果实上则常会出现褪绿斑点或环形斑(CABI,2019; Cambraetal.,2019)。罹病的李子或杏常在叶片和果树上出现典型的痘泡症状，果实畸形、果肉褐变或黑化、未熟先落等；杏和欧洲李子果实的畸形症状与苹果褪绿叶斑病毒Applechloroticleafspotvirus引起的症状极为相似(Cambraetal.,2019)；而在杏核上则会出现灰白色环形斑或斑点，种子褪绿、顶梢枯死等(Dunez,1987)。通常，PPV的危害症状与发生地点、发病季节以及李属植物的种、品种和侵染的植物组织(叶片或果实)等密切相关(Dosbaetal.,1986; Kegler & Hartmann,1998; Nemchinovetal.,1998a)。

1.3 株系

根据症状学、致病性、宿主范围、媒介蚜虫的传播方式、流行病学、基因组序列等差异，李痘病毒的分离物可分为9个单源株系，即D(Dideron)、M(Marcus)、EA(E1Amar)、C(樱桃)、W(Winona)、Rec(重组)、T(土耳其)、CR(俄罗斯樱桃)和An(始祖Marcus)株系等(Jamesetal.,2013)。其中D和M株系是较为流行的2种株系(CABI,2019; Cambraetal.,2019)。D株系最早发现于法国杏树上，并在北美洲的美国、南美洲的智利等国家严重危害，但经蚜虫传播后，其侵染植株的能力变弱，而且蚜虫的传毒效率比较低(Levyetal.,2000a)。M株系最早发现于希腊的桃树上，在欧洲广泛分布，且只在桃树上发生，蚜虫对其传播能力较强，侵染植株的能力亦较强，在李痘病毒的9个株系中，该株系是侵染力最强的株系(Cambraetal.,2019; Levyetal.,2000a)。EA株系主要分布于北非地区，可侵染杏树。在埃及，当天气炎热、气温较高时，其侵染症状并不表现(Llácer,2006)；并且EA株系与D和M株系在RNA序列上存在差异(Wetzeletal.,1991a)。一些欧洲国家鉴定出侵染甜樱桃和酸樱桃P.cerasus的PPV分离物，被分别命名为C株系和CR株系，在意大利、匈牙利、保加利亚、摩尔多瓦等国家均有分布(Cambraetal.,2019; Crescenzietal.,1995,1997; Kalashyanetal.,1994; Kölberetal.,1997; Nemchinov & Hadidi,1996; Nemchinovetal.,1995,1996,1998a,1998b; Topchiiska,1991,1996)；C株系在生物学、血清学和分子特性上与其他李痘病毒株系存在显著差异。W株系于加拿大发现(Jamesetal.,2003; James & Varga,2005)，但据报道，该株系可能起源于欧洲，且至今在欧洲仍然存在(Croftetal.,2008)。Rec株系是D株系和M株系自然重组形成的重组型株系，具有共同的系统发育联系，最早在欧洲东部的斯洛伐克发现(Glasaetal.,2002,2004)。T株系是近期土耳其报道的另外一种重组株系分离物(Ulubaetal.,2009)。An株系推测可能是M株系的一个先祖(Palmisanoetal.,2012)。此外，近年还有人提出了一新的酸樱桃适应性假定株系(Tat)，该假定株系既非C株系亦非CR株系(Chirkovetal.,2016)。

此外，有报道显示，在意大利、德国、摩尔多瓦和匈牙利等欧洲国家，PPV的C株系可以自然侵染酸樱桃和甜樱桃/欧洲大樱桃(Crescenzietal.,1995,1997; Nemchinovetal.,1996,1998a)；并且，该株系已经借助人工嫁接或媒介昆虫将PPV传播给了其他核果类果树(Crescenzietal.,1997; Kalashyanetal.,1994; Nemchinovetal.,1996)。此外，多数野生或观赏型李属种类可以通过蚜虫取食、人工嫁接等方式，感染PPV的D株系(Damsteegtetal.,1997)。

1.4 环境适应性

PPV喜欢温带—中温带的气候条件(最冷月平均温度0～18 ℃，最热月平均温度10 ℃以上)，对终年潮湿的暖温带气候(温暖季平均温度>10 ℃，寒冷季平均温度>0 ℃)亦能忍受(CABI,2019)。PPV具有比较广的温度适应范围，最热月平均最高气温30～40 ℃、最冷月平均最低气温-25～0 ℃的温度范围均适合其发生。此外，其对降雨量亦无特殊需求，干旱季节(月降雨量<40 mm)持续时间1～2 m、年平均降雨量0～900 mm，对该病毒发生均无明显不利影响(CABI,2019)。

2 传播扩散方式

2.1 介体传播

蚜虫是PPV的主要传播媒介，有翅蚜在染病植株上取食危害后多迁飞到其他植株上继续刺吸取食，因此，受PPV侵染的植株数量常与有翅蚜的种群密度密切相关(CABI,2019)。Gottwaldetal. (1995)分析西班牙东部蚜虫传毒的空间分布格局后认为，蚜虫可以将PPV传播到几株树以外的植株上，而不是直接传播到紧邻的植株上。蚜虫主要以非持久性方式传播PPV，可从感病植株的叶片、花或果实以几秒钟到几分钟的速度快速获取病毒，并能在几分钟内将病毒传给新的植株，而且不存在潜伏期(CABI,2019)。目前，已知的能传播李痘病毒的蚜虫共计14种，包括苜蓿蚜Aphiscraccivora、黑豆蚜A.fabae、棉蚜A.gossypii、常春藤蚜A.hederae、绣线菊蚜A.spiraecola、李蓟圆尾蚜Brachycauduscardui、杏圆尾蚜B.helichrysi、桃黑短尾蚜B.persicae、桃大尾蚜/梅大尾蚜Hyalopteruspruni、桃蚜Myzuspersicae、桃卷叶蚜M.varians、忽布疣蚜Phorodonhumuli、禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi、麦无网长管蚜Metopolophiumdirhodum等。而这些蚜虫多为世界性分布，如棉蚜、桃蚜、苜蓿蚜等。

2.2 人为传播

李痘病毒主要通过带毒的种子或砧木、苗木等繁殖材料，借助人类活动(种苗流通、嫁接等)进行远距离传播；而短距离扩散主要依赖带毒媒介蚜虫(CABI,2019)。嫁接传播是疫区病害扩散的最主要方式，尤其是使用未经认证许可的繁殖材料；李痘病毒在区域间或国家间的传播，亦与使用未经认证的繁殖材料密切相关(Diekmann & Putter,1996)。如，在东欧出口到美国的果树材料上时常截获到PPV(Waterworth,1994)。

2.3 种子传播

尽管种壳和子叶均可检测到李痘病毒，但其胚胎组织和幼苗不表现出任何症状，且酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和PCR检测亦均呈PPV阴性。迄今为止，没有任何PPV分离株被发现可以通过种子传播。因此，PPV从染病母株向其后代垂直传播的可能性很小(Pasquini & Barba,2006)。

3 经济影响

李痘病毒对很多国家核果类果树(杏、李、桃等)的安全生产存在巨大风险，而且已经对发生国植物材料的出口认证带来了不利影响。如，PPV严重影响欧洲的水果产业(Kegler & Hartmann,1998; Nemchinovetal.,1998a; Németh,1994)，尤其是在欧洲的中部和东部区域，并不断向埃及(Mazyadetal.,1992; Wetzeletal.,1991a)、西班牙(Lláceretal.,1986)、葡萄牙(Louro & Monte,1986)以及智利(Herreraetal.,1998)等地中海沿岸国家扩散。特别是核果类果树，一旦被感染便损失惨重，部分高感品种直接产量损失高达83%～100%(Kegler & Hartmann,1998; Nemchinovetal.,1998a; Waterworth & Hadidi,1998)。此外，PPV危害造成的间接经济损失亦不能小觑；据估算，自20世纪70年代以来，全球每年用于与李痘病毒防治相关的费用(不包括间接贸易成本)达100亿欧元(Cambraetal.,2006)。

4 诊断检测方法

4.1 生物学鉴定

生物学鉴定方法，即通过汁液摩擦或嫁接将PPV接种到指示植物/鉴别寄主上，根据鉴别寄主表现特征的不同，从而达到鉴定病毒的目的。迄今，生物学鉴定法依然是病毒鉴定的一种基础方法(谷大军和张琪静, 2013)。李痘病毒的指示植物主要有红叶李栽培品种GF31、桃砧木品种GF305，以及李和山桃杂交后的栽培品种Nemaguard或毛樱桃等；用于生物学鉴定的指示植物/鉴别寄主的物候期为幼苗期(CABI,2019)。此外，由红叶李栽培品种GF31、桃砧木品种GF305和毛樱桃杂交种(IR473×IR474)构成的组合鉴别寄主，接种6～8周后即能表现症状，可用于区分李痘病毒的M株系和D株系(CABI,2019; Damsteegtetal.,1997)。

4.2 免疫学法

应用最为广泛的免疫学方法是酶联免疫吸附测定法，该方法首次应用于李痘病毒的检测，可明确根、树皮、花、叶、果实或种子中是否带毒(Adams,1978)。尤其对于大量样本的筛选检测，ELISA法是首选(Cambraetal.,2019)。此外，利用PPV的单克隆和多克隆抗体不仅可以检测鉴定PPV，还可鉴定其所有的9个株系。如，单克隆抗体5B-IVIA可有效区分M、D、EA和C株系(Cambraetal.,1994)；同时，该方法还可用于定量检测(Himmleretal.,1987)。此外，基于透射电镜(亦即免疫电镜)(Kerlanetal.,1981)和胶体金染色法(Himmleretal.,1989)亦可用于PPV检测。马洁等(2012)研发的由2个单克隆抗体混合的酶联免疫吸附TAS-ELISA(三抗体夹心ELISA, triple antibody sandwich ELISA)试剂盒可检测D和M株系，且特异性强，在PPV检测鉴定中具有重要作用。

4.3 分子生物学法

分子生物学技术方法的应用，大大提高了PPV检测的灵敏度、准确性和检测效率(郑耘等, 2008)。目前，于PPV检测的分子生物学方法主要有PCR法、实时荧光反转录PCR(real-time fluorescent reverse transcription PCR, real time RT-PCR)法、双重PCR法(diplex PCR)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)(Varga & James,2006)、基因芯片(DNA chip)技术、新一代测序技术(Rodamilansetal.,2014)等。PCR技术使PPV的检测灵敏度达到了10 fg纯化病毒RNA(Wetzeletal.,1991b)；免疫技术与PCR技术相结合的免疫PCR(immuno PCR, IPCR)技术，以及PPV高灵敏度生测技术—免疫捕捉PCR(Immunocapture-PCR, IC-PCR)检测技术也已研发成功(Candresseetal.,1994,1998)。而后，印记捕获PCR(imprint capture PCR)替代IC-PCR技术，该方法无需样本研磨，且在捕获阶段可以许多蛋白替代PPV特异的免疫球蛋白(Candresseetal.,1998)。实时荧光反转录PCR技术亦已用于检测PPV，并可稳定地检测出0～20 fg的病毒RNA(Schneideretal.,2004)，并可用于株系鉴定(高雅红等，2011)。多重RT-PCR(multiplex RT-PCR)检测技术相较于ELISA或分子杂交分析更加灵敏、经济、省时，且能快速区分PPV与其他核果类果树病毒(Sánchez-Navarroetal.,2005)。将基于核酸序列的扩增法与快速导流杂交法相接合用于PPV检测，其检测灵敏度比ELISA法提高1000倍(Olmosetal.,2007)。而直接实时PCR(direct real-time PCR, drtPCR)技术可用于田间样本的规模化检测(Kimetal.,2008)。目前，使用的血清学和分子检测方法一般情况下均可鉴定出PPV的D和M株系(Cambraetal.,2019)；陈定虎等(2017)研发的基因芯片检测技术，可快速扩增6个株系(即D、M、EA、C、W和Rec株系)中的任一株系，且检测结果直观、准确，在口岸检疫中具有举足轻重的作用。霍亚云(2018)研究建立的李痘病毒恒温扩增检测技术，不仅特异性好，还能快速区分多种核果类果树病毒，可以在实验室及海关推广使用。

5 预防控制技术

5.1 检疫措施

鉴于李痘病毒可通过种苗传带，一方面要加强口岸检疫，防止该病毒跨境传入我国，尤其以生产为目的引进果树和花卉种苗，要在海关总署指定的进境口岸入境，且要根据引进目的在隔离检疫圃隔离种植至少2个生长季，观察并检测植株是否带毒；另一方面要加强调运检疫，在种苗调运前要进行严格的产地检疫、调运检疫、种苗复检、田间监测等，对湖南等地的李痘病毒进行跟踪监测，防止通过国内花卉苗木的调运进一步传播和扩散蔓延。

5.2 彻底清除感病植株

在新果园建立前应彻底清除李痘病毒侵染过的所有核果类果树，此乃有效清除PPV的唯一途径，在轻度感染地区新果园的建设中尤为重要和适用。在已发病果园，采取生长期专业人员检测、彻底销毁阳性发病株及其周边500 m内的植株等措施，对PPV亦能起到明显的控制作用(谷大军和张琪静,2013; Gougherty,2011)。

5.3 控制传播媒介

蚜虫是李痘病毒的主要传播媒介。通常，有效的控制方法就是在认证体系下种植健康植株，定期施用杀蚜剂防治蚜虫，并销毁果园中所有的病株，这些方法在法国、意大利等国家常被用于抑制李痘病毒的发生(Barba,1998; Kegler & Hartmann,1998)，且收效显著。

5.4 选育抗病或耐病品种

借助常规育种或通过转基因选择育种，培育或选育抗病或耐病品种是控制李痘病毒最有效的途径(Cmaraetal.,1992; Escalettesetal.,1994; Ravelonandroetal.,1998; Scorzaetal.,1998)。通过不同类型或不同PPV抗性机制，已经培育或选育出抗PPV的李、杏、桃和油桃等新品种(Hartmann,1998; Kegler & Hartmann,1998; Lahmatovaetal.,1998; Papršteinetal.,1998; Rankovi & Paunovi,1989; Scorzaetal.,2007; Tomaetal.,1998)。

5.5 繁育无毒苗木

病毒在染病植株上的分布并非一致。通常，在老叶以及成熟的组织和器官中病毒的含量较高，嫩叶及未成熟的组织和器官中的含量较低，而生长点则几乎不含病毒(陈正华,1986)。据此，利用微茎尖(<0.2 mm)脱毒原理(曹孜义,1998)进行脱毒，即可获得无毒苗木。目前，该技术在我国已用于杏的脱毒以及组培快繁(邓成军等,2005)。

6 展望

李痘病毒仅在我国局部区域分布，但其对核果类果树的危害严重，潜在威胁巨大，加之PPV可以借助李属果树或花卉繁殖材料远距离传播扩散，而我国每年从国外输入的李属果树种子、砧木、芽条以及果实等的数量较大，漏检或假阴性现象时有发生，因此，再次传入我国及进一步传播扩散的可能性极大。而且，我国桃、李、杏等核果类果树和花卉随处可见，适于其侵染的品种也是我国南北方的主栽品种，栽培面积大(郑耘等,2008)。此外，传播PPV的主要媒介蚜虫在我国亦多有分布，且我国的气候类型与PPV主要疫区欧洲国家的气候类型非常相似，均为PPV在我国的成功定殖乃至暴发成灾提供了可能。因此，应加强口岸进境核果类种子、砧木、芽条等繁殖材料检验检疫工作，杜绝传染源，切断其传入途径，确保我国核果类果树和园林花卉产业的健康发展。