玉屏风散干预变应性鼻炎的网络药理学机制

向凤， 彭桂原， 黄小安， 李林蔓， 钱湃梓， 黄桂烂， 林洁玲

（广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510006）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是耳鼻咽喉头颈外科临床最常见的疾病之一，保守估计全球的变应性鼻炎患者超过5亿[1]。相关文献[2]表明，变应性鼻炎在我国大陆地区人口中的患病率为4%～38%，不同地区间差异较大。国内外大量的流行病学调查显示，近年来变应性鼻炎的患病率明显上升，导致较大的疾病负担[3]。目前，变应性鼻炎以抗组胺药、激素治疗为主，虽然具有缓解症状的功效，但是并未从根本上使其恢复，并且长期反复使用也存在一定的副作用。中药复方具有多靶点、多功效的特点，在预防和治疗变应性鼻炎中具有很大的潜力。

玉屏风散，最早出自于元代朱震亨的《丹溪心法》，由黄芪、白术和防风3味中药组成，具有益气固表止汗之功效[4]。据报道，该方常用于治疗现代医学的变应性鼻炎、哮喘、荨麻疹等变态反应性疾病[5]。现代研究[6]表明，该方通过抑制肥大细胞活化，从而改善变应性鼻炎的过敏性症状。玉屏风散中黄芪既可以在免疫低下时提高机体免疫力，又可以在炎症持续时，降低促炎因子的产生发挥免疫抑制作用，具有双向调节作用[7]。防风具有抗炎、抗氧化、免疫调节的作用[8]。白术具有修复黏膜、抗炎的作用[9]。

网络药理学以多基因、多靶点、多通路的特点与复杂疾病的治疗理念相吻合，通过成分—靶点—通路—疾病等可视化网络模型的构建，可全面研究中药复方在治疗疾病时参与调控的多种信号通路，结合分子功能、生物学过程分析，对分子层面的作用机制进行解释[10]。因此，本研究采用网络药理学的方法总结玉屏风散治疗变应性鼻炎的药效成分及靶点，并通过系统生物学分析，深入揭示玉屏风散成分—靶点—通路—疾病之间的协同作用，初步探索玉屏风散治疗变应性鼻炎的作用机制，为后续研究提供新的思路，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 药效成分收集筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）中以黄芪、白术、防风为关键词查询筛选化学成分。该数据库中包含了约500种《中华人民共和国药典》中收载的药物，能够提供成分的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）数据及靶标、疾病信息[11]。口服生物利用度（OB）和类药性（DL）是评价一个化合物是否可发展成为一个药物的重要指标[12-13]。参考相关文献，本文将OB和DL分别设置为＞30%和＞0.18，将筛选得到的化合物作为候选成分。

1.2 药效成分靶点预测 通过Pubchem检索出每一个候选成分的简化分子线性输入规范（Simles）号，并将Simles号带入swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）网站自动筛选出可能性（Probability，P）值靠前的基因作为候选靶基因，并以Excel形式整理备用。

1.3 疾病靶点预测 在预测人类基因的数据库（GeneCards， http：//www.genecards.org/）搜 索“allergic rhinitis”，得到与变应性鼻炎相关的基因，作为疾病的候选靶点基因。

1.4 网络构建与分析 将查找筛选的玉屏风散药效成分及预测的相关靶点以Excel导入Cytoscape 3.3.0软件，得到玉屏风散成分—靶点网络图。将预测整理的疾病靶点导入在线蛋白质互作（String）数据库，将物种（Organizm）设置为人类（Homo sapiens），分析获得疾病靶点蛋白互相作用（PPI）图，将疾病靶点相互作用关系导入Cytoscape 3.3.0软件得到疾病—靶点网络图。采用该软件混合（Merge）功能将2个互作图合并得到成分—靶点—疾病网络图。通过在线String数据库对筛选得到的玉屏风散干预变应性鼻炎潜在靶点基因进行基因本体论（GO）功能富集分析，采用Cytoscape 3.3.0软件中的Clue GO插件对输入的潜在靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集注释分析，将富集得到靶点—通路网络与成分—靶点—疾病网络合并，得到成分—靶点—通路—疾病相互作用网络。

2 结果

2.1 筛选预测结果 根据OB＞30%和DL＞0.18原则，共筛选得到35种候选药效成分，其中防风16个、白术4个、黄芪15个，详细信息如表1所示。其中实验已明确证实欧前胡素（ammidin）能够显著改善哮喘小鼠气道炎症细胞浸润、减轻黏液分泌及杯状细胞增生，抑制气道胶原沉积，同时通过调节白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13、干扰素γ（IFN-γ）等细胞因子调节哮喘小鼠的T细胞（Th）1/Th2失衡，其机制可能与p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）/核因子κB（NF-κB）有关，表明欧前胡素是一种潜在的抗炎药[14]。肖炜明等[15]总结汉黄芩素（wogonin）可通过增加免疫细胞的浸润、调节免疫细胞的表型以及促进相关细胞因子的分泌来增强免疫功能。在Otuki等[16]建立的炎症模型中，NF-κB途径显示α-香树素（α-amyrin）的局部治疗可保护人NF-κB抑制蛋白α（IκBα）降解，p65/Rel A磷酸化作用和NF-κB活化，降低前列腺素E2（PGE2）。周运江等[17]发现山柰酚（kaempferol）能够降低卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎豚鼠模型血清中组胺、免疫球蛋白IgE、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-4的水平，抑制鼻黏膜组织中TNF-α、IL-4的表达水平，减少鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞的浸润，从而改善过敏性鼻炎的症状。彭炜等[18]研究发现槲皮素（quercetin）可显著抑制变应性鼻炎大鼠鼻黏膜嗜酸性细胞浸润，显著改善鼻黏膜水肿、血管扩张、腺体增生，并且槲皮素能显著提高IL-2、IFN-γ，抑制IL-4、IL-5水平，调节Th1/Th2细胞因子平衡，从而对变应性鼻炎大鼠产生保护作用。

通过Swiss Target Prediction数据库自动筛选P值靠前的基因作为候选靶基因，得到对应的靶点基因名称。共得到玉屏风散化学成分—候选靶点关系480对，用Excel 2019表格整理。GeneCards数据库中检索变应性鼻炎，共得到981个与变应性鼻炎相关的基因，作为疾病候选靶点基因。2.2 网络构建结果

2.2.1 成分—靶点网络构建 将得到的玉屏风散成分—靶点关系以Excel格式导入Cytoscope 3.3.0软件中，得到玉屏风散成分—靶点网络，如图1所示。该网络共包含212个节点，480条边，其中35个节点代表药效成分，177个节点代表与药效成分相关的靶点基因。网络平均邻节点数为4.52。

2.2.2 疾病靶点相互作用网络构建 将变应性鼻炎相关的靶点基因导入在线String数据库得到疾病靶点PPI图，将疾病靶点相互作用关系导入Cytoscape 3.3.0建立疾病靶点相互作用网络图，如图2所示。该网络共有736个节点和23 010条边，网络平均邻节点数为62.527。

2.2.3 成分—靶点—通路—疾病相网络构建 利用Cytoscape 3.3.0中的Merge功能将成分—靶点网络和疾病靶点相互作用网络合并，得到成分—靶点—疾病网络图（见图3），合并成分—靶点—疾病网络图和靶点—KEGG通路网络图得到成分—靶点—KEGG通路—疾病网络图（见图4）。通过对网络的拓扑结构分析得到药效成分节点数如表1所示。网络中共有81个节点和305条边，其中35个节点代表药效成分，27个节点代表与变应性鼻炎相关的疾病靶点，19个节点代表与疾病靶点相关的通路。网络平均邻节点数为7.531。表2为玉屏风散干预变应性鼻炎的预测靶点。

表1 候选药效成分筛选结果表Table 1 The information of the candidate medical constitutes screened out

图1 成分—靶点网络图Figure 1 The constitute-target network

图2 疾病靶点相互作用网络Figure 2 The disease targets interaction network

2.3 网络分析结果 通过String数据库对玉屏风散成分靶点与变应性鼻炎基因靶点映射的共有基因进行GO分析，排名前10的分子功能类别和生物学过程类别见表3、4。发现玉屏风散可通过信号受体活动、氧化还原酶、一氧化氮合酶活性、G蛋白偶联胺受体活性等分子功能及有机物的应答、调节刺激的应答、多细胞生物的过程等生物学过程调控变应性鼻炎。

图3 成分—靶点—疾病网络图Figure 3 The constitute-target-disease network

图4 成分—靶点—KEGG通路—疾病网络图Figure 4 The constitute-target-KEGG pathwaydisease network

将27个共有基因导入Clue GO插件进行通路富集注释分析，得到24条P＜0.05的显著富集信号通路，见图5。通过阅读文献从排名前19的KEGG代谢通路中选出可能与变应性鼻炎相关的通路，并将其与玉屏风散的活性成分、共有靶点构建“成分—靶点—KEGG通路—疾病”的多维网络图。结果表明，玉屏风散能通过钙离子（Ca2+）、缺氧诱导因子1（HIF-1）、IL-17、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（ErbB）等信号通路调节变应性鼻炎的进程。表明玉屏风散抗变应性鼻炎与Ca2+流通、细胞低氧应答、炎症因子、血管内皮生长因子分泌等相关。

表2 玉屏风散干预二型糖尿病过敏性鼻炎的靶点预测结果Table 2 The information of the predicted targets of Yupingfeng Powder for the intervention of allergic rhinitis

表3 共有基因的GO分子功能分类Table 3 GO molecule function classification of the common genes

表4 共有基因的GO生物学过程分类Table 4 GO molecule biological process of the common genes

图5 玉屏风散治疗过敏性鼻炎的潜在靶点KEGG通路富集分析Figure 5 The KEGG pathway analysis of the predicted targets of Yupingfeng Powder for the intervention of allergic rhinitis

3 讨论

玉屏风散的临床应用极为广泛，主治中医学的各种汗证、虚证，以及治疗现代医学的皮肤系统、肾脏系统、消化系统、呼吸系统疾病等多科疾病[19]。特别指出的是玉屏风散在呼吸系统疾病中取得明显的治疗效果，尤其在变应性鼻炎上。大量文献表明，无论玉屏风散加味还是玉屏风散加味结合西医疗法都既能迅速缓解变应性鼻炎的临床症状，又能巩固疗效，其近期和远期疗效均优于单纯西医治疗[20]。中医学认为，本病病机为本虚标实，内虚为本，外感为标，同时本病的发生、发展及病情转归与肺的功能状态关系密切。肺气亏虚，卫表不固，则外感邪气乘虚而入，发为此病。临床上，玉屏风散以补气固表药为主，配合小量祛风解表之品，使补中寓散。现代研究表明，玉屏风散对细胞因子及机体免疫具有调节功能[19]，在某一程度上改善变应性鼻炎的症状及发展。中药方剂成分复杂、靶点广泛、作用途径多样、功能丰富，玉屏风散治疗变应性鼻炎的具体作用机制尚未完全阐明。

在本研究中，我们应用OB、DL等指标、药物的多种成分、网络分析等预测玉屏风散与变应性鼻炎相关的活性成分和靶标，分析其治疗作用可能存在的通路。其中相关性高的靶标有基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、一氧化氮合成酶1（NOS1）、白三烯B4（LTB4）、表皮生长因子受体1（ErbB1）等。有文献[21]报道，MMP-2、MMP-9在过敏性鼻黏膜中表达增加，MMP-9和肥大细胞之间具有强相关性，提示MMPs可能有助于炎症细胞（如肥大细胞）向变应性鼻炎患者鼻黏膜的迁移，表明MMPs在变应性鼻炎形成中的积极作用。有研究[22]表明，NOS1内含子20的AAT多态性可能导致变应性鼻炎的易感性。LTB4是一种对中性粒细胞和嗜酸性粒细胞都有活性的天然发生的非常强效的趋化因子[23]。有文献[24]证明，在鼻子局部的过敏反应中也产生了有效的化学反应因子LTB4。ErbB1、2属于ErbB受体家族，也称为I型受体酪氨酸激酶，研究[25]表明ErbBs在上、下气道炎症病理过程中可能发挥作用。一个特殊的膜域紧密连接最顶端的极化上皮细胞和内皮细胞以维持细胞极性（屏障功能）[26]。细胞生物学研究[27]表明，ErbB的调控和激活与膜域完整性有关，而膜域完整性与上皮发育、损伤和肿瘤发生密切相关[28]。研究发现，HIF-1信号通路、IL-17信号通路、VEGF信号通路、Ca2+信号通路、ErbB信号通路为变应性鼻炎发病机制中重要的通路。有文献报道，缺氧在变应性鼻炎的发病机制中起重要作用，其可以使鼻黏膜中的IL-17A水平升高，而IL-17A主要由分化的辅助性Th17产生，Th17细胞在多种炎症以及自身免疫性疾病中起着重要的作用，其分泌的IL-17能在缺氧环境中通过介导细胞内的NF-κB以及P13K/AKT途径，激活下游的HIF-1α以及VEGF等信号分子。活化的HIF-1α能够通过调控其他生长因子的表达，直接参与血管生成并加重变应性气道炎性反应[29]；HIF-1α高表达能够促进VEGF的表达，VEGF也是炎性反应、气道重塑和生理失调的强有力刺激剂[30]。Ca2+作为第二信使，在脂多糖（LPS）的活化过程中，具有重要的信号传导作用。Ca2+能够传递外界刺激的信号，启动基因转录，促使细胞分泌大量的炎性细胞因子[31]。玉屏风散对变应性鼻炎的干预作用可能是通过以上关键基因及重要通路发挥作用。

网络药理学整合了大量的生物信息学方法，在探讨中药的药理学和寻找新药或药物组合方案等方面具有非常广阔的前景[32]。通过对玉屏风散进行网络药理学分析，我们得到玉屏风散的35个化学成分，这些成分可通过与MMP-2、MMP-9、NOS1、LTB4、ErbB1等关键靶点，调控Ca+、HIF-1、IL-17、VEGF、ErbB等信号通路，从调节Ca2+流通、细胞低氧应答、控制炎症因子释放等多环节发挥治疗作用。本项研究基于多成分、多靶点、多通路理论探讨玉屏风散治疗变应性鼻炎的干预机制，对药效成分、作用靶点和药理机制深入阐明，对提升中药的认可度和接受度大有裨益。但是，由于数据库信息不全面，化合物筛选的主观性，且只关注药物的组成成分，忽略了其成分的含量、化合物之间的相互作用以及药物体内代谢过程等的影响，故本研究预测的结果具有一定的片面性和局限性。本研究尚处于理论上预测探讨玉屏风散治疗变应性鼻炎作用机制的阶段，下一步将以临床研究和实验研究进行相关验证工作，以明确网络药理学研究结果的可靠性。