射干麻黄汤对哮喘性肺炎大鼠肺部炎症反应及免疫反应的影响

陈豪， 陈军红， 沈旭波， 吕可君

（1.永康市第一人民医院，浙江永康 321300；2.上海市岳阳医院肿瘤科，上海 310000）

哮喘又名支气管哮喘，是一种由嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞等炎症细胞和细胞成分参与的慢性气道炎症发展而来严重影响人类健康的慢性炎症性呼吸系统疾病[1]。其发病率逐年上升，虽然医学者们已经做了诸多努力来提高治疗效果，但其仍无法治愈，给世界各国的公共卫生带来了沉重的负担[2]。世界卫生组织发起以每年5月的第1个星期二为世界哮喘日，用来提醒公众对该病的认识并加强该病的预防和治疗[3]。射干麻黄汤出自《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》“咳而上气，喉中水鸡声，射干麻黄汤主之”，是内科治疗呼吸系统疾病常用的方剂[4]。已有大量临床研究[5-6]表明，中药射干麻黄汤治疗支气管哮喘疗效确切，具有远期疗效稳定、不良反应少、毒副作用罕见等特点，但其具体作用机制尚不明确。本研究主要探讨射干麻黄汤对哮喘性肺炎大鼠肺部炎症反应及免疫反应的影响，以期为哮喘病的临床应用提供参考数据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 6周龄SPF级健康雄性SD大鼠120只，体质量190～200 g，购自浙江省医学科学院，动物质量合格证号：SYXK（浙）2017-0010。于浙江省医学科学院进行动物饲养，室温24～25℃，湿度45%～55%。

1.2 药物及给药剂量 射干麻黄汤由射干9 g、麻黄12 g、生姜12 g、细辛9 g、紫菀9 g、款冬花9 g、大枣7枚、半夏9 g、五味子3 g、甘草3 g组成，水煎剂（生药量2.0 g/mL）由永康市中医院中药房提供。参照文献[7]与魏伟主编的《药理实验方法学》[8]，根据成人标准体质量60 kg的临床每日常用剂量（1付）计算成人用药剂量（1.2 g/kg），按大鼠每日等效灌胃剂量为人类的9倍，确定大鼠灌胃低剂量为9倍等效人体剂量（10.0 g/kg），中剂量组为18倍等效人体剂量（20.0 g/kg），高剂量组为36倍等效人体剂量（40.0 g/kg）。地塞米松片购自上海信宜制药股份有限公司，0.75 mg/片，批号：17021512。

1.3 试剂与仪器 鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）购自美国Sigma公司；白细胞介素（IL）-4、IL-13和肿瘤坏死因子（TNF-α）的酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒购自上海通蔚实业有限公司；抗CD4-FITC、抗CD25-PC5、抗CD28-FITC、IgG1-FITC、IgG1-PE购自北京义翘神州科技有限公司；抗胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）抗体、Toll样受体4（TLR4）抗体、核因子κB（NF-κB）抗体、HPR标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司。402型超声雾化器（上海四菱医疗器械厂）；CytoFLEX LX流式细胞仪（中国贝克曼库尔特商贸有限公司）；普朗DNM-9602G酶标仪（济南百源医疗设备有限公司）；美国Bio-Rad伯乐Gel DocTM XP凝胶成像系统（上海巴玖设备有限公司）。

1.4 造模方法 参考文献[9]的OVA激发方法复制哮喘性肺炎大鼠模型。在实验第1天和第8天，100只SD大鼠腹腔注射含10%液态铝10 g/L的OVA混悬液2 mL，14 d后用超声雾化的1%OVA液激发，每次30 min，共4周。将其余20只SD大鼠设为空白组，用生理盐水代替OVA混悬液，步骤同上。以大鼠出现呼吸急促、喘息、双肺闻及哮鸣音、躁动，甚至出现口唇、耳紫绀等表现视为造模成功。

1.5 分组、给药及取材 实验设置6组，即空白组，模型组，地塞米松组，中药低、中、高剂量组，每组20只大鼠。至激发第3周周一开始，每天上午继续雾化OVA液，下午给予药物处理。空白组和模型组给予等量的生理盐水灌胃；地塞米松组给予剂量为1.0 mg·kg-1·d-1的地塞米松溶液灌胃；中药低、中、高剂量组给予射干麻黄汤（剂量分别为 10.0、20.0、40.0 g·kg-1·d-1）灌胃。每天1次，共计14 d。取材：给药结束后，将大鼠麻醉后，采血，颈椎脱臼法处死动物，取肺。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 观察大鼠一般状态 在实验过程中观察大鼠死亡情况以及活动状态。

1.6.2 苏木素—伊红（HE）染色观察肺组织病理 取肺固定后，常规石蜡切片，然后按照HE染色液说明书进行染色：先将切片脱蜡、水洗、苏木素染色、水洗，再用1%盐酸酒精分化、水洗，0.6%氨水返蓝、水洗，0.5%伊红液染色、水洗，再脱水、二甲苯透明。最后用中性树胶封片，在400倍显微镜下观察。

1.6.3 称质量法测定肺组织湿干质量比 取新鲜右肺中叶称湿质量，然后置于80℃恒温烤箱烘烤至恒质量，再称干质量。肺组织湿干质量比=肺湿质量/肺干质量。

1.6.4 牛鲍氏计数板计算血液中白细胞数目 取抗凝血0.5 mL牛鲍氏计数板进行白细胞计数，计算血液中白细胞数量。

1.6.5 ELISA法检测肺组织匀浆中炎症因子IL-4、IL-13、TNF-α含量 按照ELISA试剂盒说明操作：将样品加入各反应孔，37℃反应45 min。后用洗涤液洗涤4次，加入生物素标记的抗体，在37℃孵育30 min。再洗涤后加链霉亲和素-HRP混合均匀，在37℃反应30 min。最后加入显色剂避光显色，加终止液终止反应。应用酶标仪检测450 nm处吸光度（OD，D），计算样本中浓度。

1.6.6 流式细胞术检测血液中CD4+CD25+、CD8+CD28-细胞所占比例 取100μL血液于流式管中，加入相应的抗体10μL，混合后于室温下避光孵育20 min，再加入2 mL红细胞裂解液，溶解红细胞10 min，以1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。最后将其悬浮于0.3 mL PBS溶液中并加入1%多聚甲醛，上流式细胞仪检测。

1.6.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测肺组织TSLP、TLR4和NF-κB表达 将肺组织研磨成匀浆，并用RIPA裂解液提取总蛋白，再用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用50 g/L脱脂牛奶室温封闭蛋白，随后加入对应的一抗（TSLP抗体1∶1 000、TLR4抗体1∶500、NF-κB抗体1∶1 000）于4℃封闭过夜。第2天加入对应HPR标记的山羊抗小鼠IgG抗体室温封闭，最后应用增强化学发光（ECL）试剂显色，曝光。由Bio-Rad凝胶Doc EZ成像仪拍摄，以GAPDH为内参，利用Image J软件分析目标蛋白带的灰度值比值（p）。

1.7 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用Student-Newman-Keul Test检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状态 在造模和给药过程中各组大鼠均无死亡。空白组大鼠活动正常；模型组大鼠开始出现频繁抓耳挠腮、上蹿下跳，后期扎堆蜷缩、精神萎靡、呼吸短促、毛发竖立，可见口唇紫绀、伸颈缩胸收腹等明显喘息表现；而随着给药时间和药量的积累，地塞米松组和中药组大鼠上述症状明显减轻。

2.2 射干麻黄汤减轻哮喘性肺炎大鼠肺组织病理改变 图1结果显示：模型组肺组织可见大量炎症细胞的浸润，并存在肺泡与间质充血、水肿；而地塞米松组和中药各剂量组肺组织炎症细胞的浸润、肺泡与间质充血水肿等症状较模型组明显减轻，且随着射干麻黄汤给药量的增加病症程度明显减轻。表明射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠肺组织病理改变。

图1 各组大鼠肺组织病理情况比较（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of rat lung tissue in various groups（HE staining，×400）

2.3 射干麻黄汤减轻哮喘性肺炎大鼠肺水肿 图2结果显示：与空白组比较，模型组大鼠肺湿干质量比明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。该结果是表明模型构建成功的指标之一，也说明哮喘性肺炎大鼠存在肺水肿现象。与模型组比较，地塞米松组和中药各剂量组大鼠肺湿干质量比明显减小，差异有统计学意义（P＜0.01），这表明地塞米松和射干麻黄汤能减轻哮喘性肺炎大鼠的肺水肿现象。另外，中药组大鼠的肺湿干质量比随着给药量的增加而逐渐减小，表明射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠的肺水肿现象。

图2 各组大鼠肺湿干质量比比较Figure 2 Comparison of the rat lung dry-to-wet mass ratio in various groups(-x±s)

2.4 射干麻黄汤减轻哮喘性肺炎大鼠炎症反应 图3-A结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血液中白细胞数量明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。该结果是模型构建成功的标志之一，也说明哮喘性肺炎大鼠存在炎症反应。与模型组比较，地塞米松组和中药各剂量组大鼠血液中白细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），这表明地塞米松和射干麻黄汤能减轻哮喘性肺炎大鼠的炎症反应。中药组大鼠血液中白细胞数量随给药剂量的增加而逐渐减少，这说明射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠的炎症反应。

图3 各组大鼠炎症反应比较Figure 3 Comparison of the inflammatory response in rats of various groups(-x±s)

图3 -B结果显示：与空白组比较，模型组大鼠肺组织匀浆中炎症因子IL-4、IL-13和TNF-α含量增加，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。该结果是表明模型构建成功的指标之一，也说明哮喘性肺炎大鼠肺部存在炎症反应。与模型组比较，地塞米松组和中药各剂量组大鼠肺组织匀浆中炎症因子IL-4、IL-13和TNF-α含量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），这说明地塞米松和射干麻黄汤能减轻哮喘性肺炎大鼠的炎症反应。中药组大鼠肺组织匀浆中炎症因子IL-4、IL-13和TNF-α含量随给药剂量的增加而逐渐减少，这说明射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠的炎症反应。

2.5 射干麻黄汤增强哮喘性肺炎大鼠免疫反应 图4结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-细胞所占比例明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），该结果是表明模型构建成功的指标之一，也说明哮喘性肺炎大鼠免疫反应减弱。与模型组比较，地塞米松组和中药各剂量组大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-细胞所占比例明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01），这说明地塞米松和射干麻黄汤能增强哮喘性肺炎大鼠的免疫反应。中药组大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-细胞所占比例随给药剂量的增加而逐渐增加，这说明射干麻黄汤可呈剂量依赖性增强哮喘性肺炎大鼠的免疫反应。

2.6 射干麻黄汤降低哮喘性肺炎大鼠肺组织TSLP、TLR4和NF-κB表达 图5结果显示：与空白组比较，模型组大鼠肺组织TSLP、TLR4和NF-κB表达量明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01），该结果是表明模型构建成功的指标之一。与模型组比较，地塞米松组和中药各剂量组TSLP、TLR4和NF-κB表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），且中药组TSLP、TLR4和NF-κB表达量随给药量的增加而逐渐减少，这说明射干麻黄汤可呈剂量依赖性抑制哮喘性肺炎大鼠肺组织TSLP、TLR4和NF-κB表达。

3 讨论

图4 各组大鼠血液中CD4+CD25+与CD8+CD28-细胞比例比较Figure 4 Comparison of the percentage of CD4+CD25+and CD8+CD28-cells in various groups(-x±s)

哮喘作为一个高度流行的慢性气道疾病，严重影响着各个年龄段人群的健康问题，其发病率和死亡率一直在快速增长[10]。关于哮喘的发病机理，中医学有“初病在肺，久病在肾”的说法[11]，因此，在哮喘发病过程中，肺部健康是关键。本研究通过HE染色和测定肺组织湿干质量比发现，哮喘大鼠肺组织存在大量炎症细胞浸润，并存在肺泡与间质充血、水肿，而射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠的这些症状。

图5 各组大鼠肺组织TSLP、TLR4和NF-κB表达比较Figure 5 Comparison of the expression levels of TSLP，TLR4 and NF-κB in rat lung tissue of various groups(-x±s)

哮喘是一种以气道炎症、黏液高分泌和气道高反应性为特征，与多种炎症介质、细胞因子和黏附分子的产生增加密切相关的疾病[10]。炎症反应的最明显标志就是发热和血液中白细胞数目的增多。本研究通过牛鲍氏计数板计算血液中白细胞数目发现，哮喘大鼠血液中白细胞数量明显增多，射干麻黄汤可呈剂量依赖性减少哮喘性肺炎大鼠血液中白细胞数目，说明射干麻黄汤可减轻大鼠炎症反应。在哮喘的发病过程中，肺部炎症反应是致病关键，炎症因子IL-4、IL-13和TNF-α在过敏性肺部炎症中发挥重要作用[12]。本研究通过ELISA法检测肺组织匀浆中炎症因子IL-4、IL-13和TNF-α含量发现，射干麻黄汤可呈剂量依赖性减少哮喘性肺炎大鼠的肺部组织中炎症因子IL-4、IL-13和TNF-α含量，从而减轻肺部炎症。

支气管哮喘的反复发作是由于免疫调节紊乱，T淋巴细胞被抗原激活成效应T细胞是哮喘免疫反应中的关键步骤之一。CD4+CD25+及CD8+CD28-T淋巴细胞是一类调节性T细胞，参与自身免疫调节，在维持自身免疫耐受中发挥了重要作用[13]。CD4+CD25+细胞主要通过直接接触抑制效应T淋巴细胞活化、增殖及杀伤毒性作用，从而与其他细胞接触发挥免疫调节作用，其数量异常会导致各种严重的超敏反应和自身免疫反应，如哮喘、过敏反应等[14]。近年来已证实CD8+C28-细胞是另一种重要的调节性细胞，这种细胞可通过上调抗原递呈细胞表面抑制受体（如ILT3、ILT4等）的表达来实现免疫抑制功能[15]。本研究通过流式细胞术检测大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-细胞数量发现，哮喘大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-细胞所占比例明显减少，射干麻黄汤可呈剂量依赖性增多哮喘肺炎大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-细胞所占比例，从而增强哮喘性肺炎大鼠的免疫反应。

哮喘发病机制的重要环节之一就是Th1细胞的细胞因子不足和Th2细胞分泌的细胞因子增多[16]。近年来诸多研究显示，胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）可促进Th2型免疫反应，从而引发哮喘或其他过敏性疾病[17]。有研究[18-19]报道，CD4+T细胞可以直接对TSLP反应，而TSLP可促进CD4+T细胞向Th2性细胞分化，同时TSLP激活的树突状细胞与CD8+T细胞作用后，能够促进其增殖分化为表达IL-4和IL-13的效应细胞。因此，增加TSLP表达可使体内Th2型细胞因子产生增加，从而推动Th2型免疫应答[20]。本研究通过Western Blot法检测各组大鼠肺组织TSLP表达的结果可知，哮喘大鼠肺组织TSLP表达明显增多，射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠肺组织TSLP表达，从而减轻Th2型细胞因子产生来减轻哮喘。Toll样受体4是一种重要的免疫模式识别受体，在包括巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞在内的免疫细胞上高度表达，控制先天和适应性免疫应答，同时介导树突状细胞的成熟、释放白细胞介素，促进细胞因子的合成和释放，促进炎症反应的产生[21]。因此，其在气道炎症的发生和调节中发挥重要作用[22]。本研究通过Western Blot法检测肺组织TLR4表达的结果可知，哮喘大鼠肺组织TLR4表达明显增多，射干麻黄汤可呈剂量依赖性减轻哮喘性肺炎大鼠的TLR4表达，从而减轻炎症反应。NF-κB位于下游TLR4信号通路，在调节免疫应答、细胞增殖和分化方面处于关键地位，是免疫调节过程的重要组成部分[23]。NF-κB能够启动炎症介质相关基因转录，并通过髓系分化蛋白促进炎症因子的产生[24]。本研究通过Western Blot检测法肺组织NF-κB表达可知，哮喘大鼠肺组织NF-κB表达明显增多，射干麻黄汤可呈剂量依赖性降低哮喘性肺炎大鼠的NF-κB表达，从而减轻炎症反应。

综上所述，射干麻黄汤呈剂量依赖性减轻哮喘肺炎大鼠的肺部病理损伤、炎症反应，增强免疫效应，并下调肺组织TSLP、TLR4和NF-κB的表达，证实射干麻黄汤可以有效减轻哮喘，提示其可作为过敏性哮喘的治疗药物，为哮喘的治疗提供了参考数据。