羊肚菌子实体组织细胞的低温冻存与复苏萌发现象的初步观察

马斐越，王清爽，周繁树，张晓，王一东

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

羊肚菌（Morchella）是一种以美味、富含营养物质而著称于世的珍稀食用菌，属于子囊菌亚门（Ascomycotina）、盘菌纲（Discomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（Morchella），具有很高的经济价值［1-2］。由于人们对于羊肚菌的生活史还不完全了解，目前的人工仿生栽培还存在较大的技术风险。所以对包括羊肚菌子实体组织细胞菌丝在内的羊肚菌各发育阶段菌丝的发生机制、发育规律等羊肚菌生活史相关的基础研究就显得尤为必要［3-6］。通过对采集的野生新鲜羊肚菌子实体进行无菌及破碎处理后，对组织细胞超低温冷冻保存，利用冷冻细胞复苏原理及有限稀释法，对复苏的羊肚菌组织细胞进行复苏后在细胞培养板孔内4℃下培养，倒置显微镜，其下观察细胞培养孔内组织细胞萌发情况，对非孢子萌发的、无污染的、具有典型羊肚菌菌丝形态的组织细胞萌发菌丝进行扩大培养，对培养物进行ELISA方法及18 s保守序列测序鉴定［7-11］，进而确定得到的子实体组织细胞萌发并分离的菌丝（菌种）为羊肚菌菌丝。该研究可为羊肚菌菌丝发育机理等基础研究及人工栽培实践提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株、羊肚菌子实体

羊肚菌（Morehella esculenta）标准菌株（51589号）购于中国农业微生物菌种保藏中心。

黑木耳（Auricularia auricula）菌种（栽培种），购于吉林农业大学菌物研究所。

野生羊肚菌子实体，于2017年5月采自于长春市净月潭国家森林公园，处理后的子实体组织细胞现保存于-80℃低温冰柜。

1.1.2 主要试剂与耗材

HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记山羊抗鼠IgG（H+L）购于北京中杉金桥生物技术有限责任公司；TMB，购于sigma公司；马铃薯培养基（PDA）；菌丝萌发液（葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、水1 000 mL，121 ℃ 20 min）；二甲基亚砜（DMSO），北化产品；其他试剂为国产分析纯试剂。

抗羊肚菌单抗C6A8杂交瘤细胞株现保存于该实验室-80℃冷冻冰箱内。抗羊肚菌单克隆抗体为C6A8细胞株腹水抗体［8］。

1.1.3 主要仪器与设备

1736R SCANSPEED高速离心机，Lrbogene公司；XD30型倒置显微镜（附摄影装置及软件），宁波舜宇公司；HZQ-QX型恒温振荡培养箱；DW-86L626型超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；ELx800TM酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；96孔、24孔一次性动物细胞培养板，1.8 ml内旋细胞冻存管，Corning公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 羊肚菌子实体样本的采集与处理

羊肚菌子实体于2017年5月10日至15日采集于吉林省长春市净月潭国家森林公园，共采集到羊肚菌标本10份，用灭菌纸包裹放入盛有冰袋的保温盒，迅速送至实验室，在超净台内将羊肚菌子实体表面泥土等杂物去除后置于无菌平皿中，用无菌生理盐水冲洗子实体表面2-3次并用无菌棉球吸干残留水分。

1.2.2 羊肚菌子实体组织细胞悬液的制备与冻存

在超净台内，将处理过的子实体按菌盖、菌柄分离，放入无菌研钵中加少量无菌生理盐水进行研磨破碎（可加入适量无菌海沙助研），取样于100×下镜检研磨的组织悬液，可见大量单个小段菌丝及少量组织碎块后终止研磨，将研磨液及生理盐水清洗研钵液体移入15 mL离心管，400 rpm离心5 min，将上清移入新的无菌15 mL离心管，3 000 rpm离心10 min后弃上清，将沉淀用细胞冻存液（90%无菌菌丝萌发液+10%DMSO混合液）悬浮，分装于1.8 mL冻存管，每管1 mL，标记名称、日期。将冻存管放入壁厚1.5 cm的泡沫保温盒中并将保温盒用胶带封口，将保温盒放入-80℃冰箱中，冻存管内的组织细胞将缓慢降温至-80℃。

1.2.3 冻存羊肚菌子实体组织液的复苏与菌丝细胞的分离培养

冻存6个月后，将上述冻存管从-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，在冻存管内冰冻固体即将完全融化时取出至室温下完全解冻，超净工作台内将冻存管内组织细胞液转入15 mL无菌离心管，滴加生理盐水至10 mL，旋紧离心管盖，2 000 rpm离心5 min，弃上清，用生理盐水重悬，重复两次生理盐水洗涤离心后将沉淀用菌丝萌发液悬浮，转移至24孔细胞培养板中，倒置显微镜下观察，估算组织细胞的密度。用菌丝萌发液将组织细胞悬液稀释至约10个/mL的终浓度，滴加96孔培养板，每孔2滴（约100 μL）。

1.2.4 4℃菌丝培养观察与筛选及扩大培养

利用羊肚菌菌丝的低温生长的特性，将细胞板边缘封口后放入4℃冰箱避光培养。每日镜检，观察孔内菌丝生长情况并拍照记录，观察是否有杂菌生长。应注意观察尽量快速，防止室温高（20℃）菌丝萌发生长过快对观察的不利影响。

在大量观察及比对分析后，选取96孔板内非孢子萌发、无杂菌、符合羊肚菌菌丝形态的培养孔内萌发生长的菌丝，吸取并移至PDA固体培养基上，室温条件下避光培养。菌落萌发后，无菌挑取疑似羊肚菌菌落接种至PDB液体培养基，置于恒温振荡培养箱中20℃，转速110 rpm摇瓶培养。

1.2.5 分离菌丝的ELISA间接法鉴定

利用该实验室的便利条件［12］，对分离并扩大培养的菌丝进行ELISA间接法检测。

1.2.6 分离菌丝的分子生物学鉴定

将分离并扩大培养得到的球状菌丝培养物送测序技术公司（华大公司）进行18 s基因测序比对，鉴定菌丝种属。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌子实体组织细胞菌丝萌发观察结果

分别于2017年11月，2018年1月、3-5月，对2017年5月冻存的羊肚菌子实体组织细胞进行了五个批次复苏，复苏情况重复性良好。通过跟踪观察及比对拍摄的大量照片，冻存后子实体组织细胞复苏萌发过程中可观察到几种现象：（1）与菌盖组织细胞相比，丝状菌柄细胞不易萌发；（2）4℃条件下培养5天左右，部分组织团块开始有菌丝萌发，20天左右在培养孔内形成肉眼可见的白色疑似羊肚菌菌丝团；（3）4℃条件下子囊孢子不易萌发；（4）在观察孔各培养菌丝生长过程中，10天左右在部分孔内观察到与羊肚菌菌丝形态不同的杂菌。

（1）菌柄组织分离结果

图1为观察低倍稀释（24孔培养板）的菌柄组织细胞，可以看出经过20天的培养没有出现萌发的菌丝，怀疑这可能与菌柄组织特殊的细胞结构有关，菌柄中含有大量的膨大状菌丝，膨大菌丝没有利用孢子萌发液的营养而萌发生长。

图1 4℃条件下接种在24孔细胞培养板20 d羊肚菌子实体菌柄组织细胞情况

（2）羊肚菌菌盖组织细胞萌发、生长情况

由图2可看出，该菌丝明显是从一个羊肚菌组织块细胞团中萌发生长的，组织细胞团中未见明显的孢子囊及孢子；萌发菌丝由薄而透明的管状壁构成，内含许多内容物，菌丝直径约8 μm，是呈竹节状的有隔菌丝，菌丝有分枝，并且能够相互融合形成网络结构，将该菌丝扩大培养的菌落编号为M10H3。

由图3可看出，羊肚菌子囊呈长圆柱形，无色透明，子囊内有有子囊孢子，单行排列，子囊孢子椭圆形，近无色，图中箭头所示的萌发菌丝是从贴近子囊结构的组织细胞萌发而不是孢子萌发，萌发的菌丝在萌发初期没有出现分支现象，其形态与图3所示菌丝基本一致。将该菌丝扩大培养的菌落编号为M10H4。在图3中可以比较明显的观察出子囊及子囊孢子，可以观察到孢子没有萌发，分析与比对实验可以确定这种现象与4℃条件下培养有关。

图2 4℃条件下羊肚菌子实体同一组织细胞团不同萌发时间下菌丝萌发生长过程

图3 孢子囊结构处萌发的菌丝生长的过程

在培养过程中还观察到一些培养孔中菌丝形态特征与羊肚菌菌丝完全不同的杂菌，部分杂菌培养后期在培养孔内形成青色菌丝团，疑似霉菌污染，对疑似杂菌污染的培养孔标记并废弃。

2.2 分离菌丝扩大培养结果

将编号M10H3、M10H4的菌丝接种PDA培养基后，分别于3 d、5 d后形成菌落。菌丝生长初期呈乳白色，贴在培养基表面呈圆形生长，有光泽，尖端分泌无色露珠，生长至菌落半径约1 cm时出现气生菌丝，气生菌丝生长初期呈乳白色。随着培养时间的延长，菌丝颜色逐渐向棕红色转变，由于色素沉积，培养基颜色也逐渐加深向棕黄色转变。随着培养时间的增加出现菌核，菌核初期为分散的点状白色小菌核，随后变成淡黄色，后期变为褐色。与文献记载［11］的羊肚菌菌落特征相符。

挑取上述菌丝接种PDB液体培养基，置摇床培养，3 d后形成菌丝球，初期为乳白色，随着培养时间的延长，培养液逐渐变得澄清透明，菌丝球体积增大，颜色变淡棕褐色。

2.3 ELISA间接法鉴定分离菌株

以P/N≥2.1判定为阳性，检测结果见表1。1孔为编号M10H3菌丝液样本、2孔为编号M10H4菌丝液样本、3孔为羊肚菌标准菌株51589菌丝液阳性样本、4孔为木耳菌丝液阴性样本、5孔为包被缓冲液（空白对照）。进行多次检测，每次检测有4组平行试验。

表1 ELISA间接法检测分离菌株结果

由表1可以看出，以标准羊肚菌抗原（51589号）为阳性对照，木耳为阴性对照，包被缓冲液为试剂空白，进行了多次的ELISA间接法检测。结果显示M10H3、M10H4均表现为阳性，确定为羊肚菌菌丝。

2.4 分离菌种的测序鉴定

分离并经扩大培养的菌丝样本，送基因测序公司经过对样本的18S保守序列的测序及比对，给出的鉴定结果为：样品与morchella sp.亲缘关系最近。可以确定分离得到的菌丝为羊肚菌菌丝。

3 结论

（1）该研究对-80℃低温保存6个月以上的新鲜羊肚菌子实体组织细胞，分别进行了5个批次的冻存的羊肚菌组织细胞的复苏，所有批次的复苏效果良好。说明该方法可以较长时间的保存羊肚菌组织细胞并可以随时进行菌丝萌发与分离。这为羊肚菌子实体组织细胞及其他不同发育阶段的菌丝细胞等实验材料的保存提供了借鉴，为羊肚菌生活史的基础研究带来便利。

（2）包括羊肚菌在内的食用菌栽培实践中，子实体的菌种分离具有不可替代的重要作用。目前广泛应用的传统的组织块平板分离实体菌种菌丝方法，存在着无法确定分离得到的萌发菌丝是由组织细胞萌发（次级菌丝）还是孢子萌发（初级菌丝）亦或是多种组织细胞与孢子萌发的混合物的缺陷，而本研究介绍的羊肚菌子实体组织细胞菌种分离方法具有可以便捷的实时观察到组织细胞萌发与生长情况、菌丝细胞来源明确的特点，避免了传统方法的缺陷。该方法可为羊肚菌子实体组织细胞萌发菌丝的确定提供直接便捷的方法参考。

（3）羊肚菌子实体存在着多种形态的细胞组织，该研究观察到的（如图4）子囊结构附近的组织细胞萌发菌丝与之前观察到的孢子萌发的菌丝（初级菌丝）在形态上基本没有差异，这是否存在着子实体组织结构细胞萌发菌丝后，其萌发的菌丝由于其环境及营养方式的改变而使萌发的菌丝（分离的菌丝）生理结构与功能发生了改变，如从羊肚菌生活史中高分化的产囊丝或是侧丝（拟侧丝）再转变为营养菌丝，如同自然界中经历了冬季低温后复苏的菌丝或是潜在的出菇点没有出菇的生殖菌丝转化为营养生长的菌丝等问题还有待于进一步的研究与分析。