蛴螬对激光损伤兔血-视网膜屏障后视网膜白细胞介素-1表达影响的研究*

★ 杨霞 蒋鹏飞 彭俊 彭清华 *** 张波涛 叶群如 江运长（.湖南中医药大学 长沙 40208；2.湖北航天医院 武汉 42000；.湖南中医药大学第一附属医院 长沙 40007）

随着激光在眼科检查及治疗的广泛应用，由激光所致的医源性视网膜光损伤也越来越多，许多眼科疾病的发生与视网膜长期光照的积累效应有关[1-2]，如老年性黄斑变性。中药蛴螬是金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子或其他近缘昆虫的干燥幼虫，属虫类药，味咸微温，有毒，在眼科应用较早。《晋书》中有此药治疗目疾的记载：“吴中书郎战冲，母王氏失明，婢取蛴螬蒸熟与食，王以为美，冲还知之，抱母恸哭，母目即开。”为观察不同剂量蛴螬提取物在视网膜光损伤后组织抗炎症反应中的作用，本研究应用不同剂量蛴螬提取物干预白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1），观察其视网膜组织病理形态学改变，探讨蛴螬提取物对视网膜光损伤兔模型保护作用的最佳剂量。

1 材料

1.1 实验动物 选用30只健康实验性兔，均为雄性，体重1.8～2.3Kg（湖南中医药大学动物实验室提供，合格证号：医动字第20-002号）。

1.2 主要实验药品和试剂 蛴螬提取物（参照参考文献[3]所用制备方法制得）、Harris苏木素（湖南中医药大学病理实验室，批号：71020784）、PV9000型二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司，批号：zb-5301）、细胞裂解液（江苏碧云天，批号：P0013）、羊抗兔二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GB23303）。

1.3 主要仪器设备和手术器材 电子秤（上海天平仪器厂， JY0001）、眼科手术显微镜（苏州医疗器械设备厂， YZZOT）、微量移液器（德国，eppendorf（1mL/200μL/10μL））、水平摇床（北京六一仪器厂，WD-9405B）、压片夹（koda）、扫描仪（日本Canon，9000F MarkⅡ）。

2 实验方法

2.1 分组方法 将30只实验性兔依次编为1～30号，通过随机数字表法：从随机数字表第3行第5个数开始抄录30个数，令这些数字除以5，余数为1划入空白组（A），余数为2划入模型组（B），余数为3划入蛴螬低剂量组（C），余数为4划入蛴螬中剂量组（D），余数为0划入蛴螬高剂量组（E），最终使每组6只动物，12只眼。

2.2 造模方法 采用自制光化学损伤装置[3]：在光照架的6个面分别放置1根40W的白色荧光灯管。调节光照强度，并用ZDS-10型数字式照度计测定大鼠活动水平多点照度，平均为2000±200 1x。动物房的室温控制在21℃～24℃，光照箱内的平均温度为22℃～25℃。所有实验动物在12h明（30-50 1x）及12h暗环境下循环光环境适应7d，自由摄食饮水。7d后光照前先暗适应24h，然后光照12h（晚上8：00至次日早上8：00），再进行暗适应12h，连续3个循环，光照时间总计为36h。实验性兔不散瞳及麻醉，可在光照箱内自由活动，光照后送回暗环境中饲养。A组不施行光照试验。

2.3 给药方法 A、B组每日以生理盐水5mL/Kg灌胃；C组按照0.45g/Kg配成5mL蛴螬提取物混悬液；D组按照成人日用量10倍剂量灌胃，为0.9g/Kg蛴螬提取物配成5mL蛴螬提取物混悬液；E组按照成人日用量20倍剂量灌胃，为1.8g/Kg蛴螬提取物配成5mL蛴螬提取物混悬液。每日灌胃1次，给药7d、14d分别处死3只兔子后取材做IL-1免疫组化检测。

2.4 取材方法 动物耳缘静脉注射空气处死后，于角膜缘后0.5mm处剪开眼球壁，将眼球壁在手术显微镜下剥离激光斑部位视网膜，脱水、石蜡包埋后切片烘干备用。

2.5 指标检测

2.5.1 HE染色观察标本视网膜细胞结构 经脱水浸蜡、二甲苯溶液脱蜡、无水乙醇洗蜡、乙醇浸泡、自来水洗、苏木素染色、乙醇盐酸分色、伊红染色、乙醇分色脱水、二甲苯溶液透明、中性树胶封片等步骤，在光学显微镜下观察并拍照。

2.5.2 IL-1免疫组化检测 石蜡切片脱蜡，用PBS（0.01mol/L，pH=7.4）冲洗5min×3次，3% H2O2室温孵育10min，蒸馏水冲洗，滴加IL-1单克隆抗体，室温或37℃孵育1～2h，PBS冲洗2min×3次，滴加1：100比例稀释的一抗，37℃孵育1h，PBS冲洗2min×3次，滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗2min×3次， DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。在高放大倍率显微镜下观察到IL-1蛋白的表达。标准如下：免疫组织化后，细胞质为棕色或深棕色为阳性标记。使用高倍显微镜随机选择5个视网膜视野用于图像分析系统定量测量各个指标阳性积分光密度，以此表示它们的含量。

3 结果

3.1 各组实验性兔视网膜组织HE染色结果 A组：实验性兔视网膜结构层次分明。B组：视网膜层次结构模糊，分界不清，出现不规则淡染。C组：视网膜外核层胞核排列较疏松。D组：视网膜外核层增厚，视网膜外核层胞核排列较整齐密集。E组：视网膜外核层胞核排列较整齐，厚度有增加。具体见图1。

3.2 各组实验性兔视网膜IL-1的表达情况 A组视网膜外核层中IL-1阳性物质分布稀疏，含量较少；B组视网膜外核层中IL-1阳性物质弥漫分布，含量较多；其余各组视网膜外核层中IL-1阳性物质有不同程度减少。见表1。

表1 各组间大鼠视网膜IL-1表达的比较（，n=6）

表1 各组间大鼠视网膜IL-1表达的比较（，n=6）

注：与空白组比较，＊P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别 第一周 第二周A组 6.08±3.46▲ 5.06±3.17▲B组 162.98±59.34＊ 101.48±13.09＊C组 74.64±9.31＊▲ 43.41±0.42＊▲D组 66.59±0.87＊▲ 32.63±2.26＊▲E组 67.26±1.46＊▲ 36.92±1.45＊▲

4 讨论

眼底激光作为高能量的单色光，其对视网膜的灼伤属于眼外伤范畴，多导致视衣气阴受损，气虚血瘀。目珠脉道幽深细微，经络分布周密，气血纵横贯目，若激光灼伤目珠，气阴受损，脉络瘀滞，使神光发越受阻，视功能减退。目得阴血而能视，气脱者目不明，神光赖其真气真血真精之滋养，方能明视万物。益气则神光有所滋养，同时，气旺以促血行；活血化瘀则目珠脉道通畅，气血可以纵横贯目，神光方能有所发越。故治疗常以益气活血化瘀为主，辅以养阴利水。蛴螬在《神农本草经》中最早有记载：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤、青翳白膜。”蛴螬有活血化瘀之效，可针对视网膜光损伤的脉络瘀滞病机治疗。

由于持续的光照，活性脂肪酸代谢和高氧消耗，视网膜光感受器细胞发生慢性氧化应激[4-5]，导致细胞内循环和降解减少，诱导视网膜感光细胞的凋亡[6]。感光细胞的大量凋亡是视网膜光损伤后视力下降的主要原因[7-10]。

IL-1不仅是细胞炎症因子，也是炎症前细胞因子，IL-1聚集往往炎症发生[11-12]。IL-1具有趋化和有丝分裂作用，还能引起组织产生增殖反应。在视网膜上，IL-1主要由视网膜Müller细胞表达，主要形式为IL-1β，IL-1β可以使视网膜组织间隙增大，有利于炎症因子的渗出，从而加剧炎症反映，破坏视网膜结构，尤其是血-视网膜屏障的破坏。

本实验发现模型组IL-1表达增强，蛴螬中、高剂量治疗组IL-1表达减少。这提示视网膜光损伤可能通过激活细胞炎症反应，引起视网膜损伤，而蛴螬可能通过抑制细胞炎症反应，对视网膜光损伤起到保护作用。