循环肿瘤DNA在乳腺癌临床诊治中的研究进展

董冰瑶 耿安琪 袁时芳 邢金良

作者单位：710032 西安 1空军军医大学第一附属医院甲乳血管外科；2空军军医大学基础医学院生理与病理生理教研室

近年来，在全球范围内乳腺癌已经取代肺癌成为女性发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁女性健康和生活质量［1］。目前乳腺癌诊断及疗效监测手段主要包括组织活检、影像学检查及传统的蛋白标志物检测。组织活检依靠手术医师的侵入性操作，重复性差，而影像学检查及传统血液生物标志物检测对乳腺癌小结节良恶性的判断及治疗疗效评估的灵敏性及准确性均不高，因此亟待寻找新型标志物用于乳腺癌诊疗全过程。近年来，“液体活检”逐渐成为精准肿瘤学的研究热点［2］，其中循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）以其独特优势在乳腺癌早期诊断、治疗反应监测、复发及转移监测等方面显示出巨大的临床应用前景，为个性化诊治提供了新思路［3］。本文就ctDNA在乳腺癌临床诊治中的研究进展进行综述。

1 ctDNA生物学特征

ctDNA是指经肿瘤细胞凋亡坏死或主动分泌释放到患者血液循环中的DNA片段，也是血液中含有肿瘤细胞基因组的直接证据［4］。在外周血中，ctDNA仅占总循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）的极少部分，平均每毫升血浆浓度仅为10～12 ng，片段长度为 130～150 bp［5-6］。UNDERHILL 等［7］研究发现，ctDNA与cfDNA的片段长度大小存在明显差异，提示从cfDNA中分离特定长度的DNA片段或可提高ctDNA的检测效率。另一项研究显示ctDNA半衰期仅为30 min至2.5 h［8］，因此ctDNA分析成为能反映癌症负担的实时“快照”。ctDNA还携带原发性实体肿瘤来源的基因变异，能反映原发肿瘤不同区域肿瘤细胞所释放DNA的基因组全貌［9］。此外，DE MATTOSARRVDA等［10］在1例肝转移的乳腺癌患者中发现，ctDNA经靶向深度测序捕获的FLP4及MAP2K2突变也存在于转移灶中，但在原发肿瘤中未检测到，说明ctDNA检测可同时捕获原发肿瘤及转移灶中的全部突变。类似研究也证实ctDNA分析有助于全面评估肿瘤异质性，实现对肿瘤细胞基因组多位点克隆进化的实时监测［9］，对临床诊治方案决策及调整具有重要的指导意义。总之，ctDNA具有的以上特点，使其成为“液体活检”中高度关注的靶标之一。

2 ctDNA与乳腺癌早期诊断

目前，关于ctDNA检测用于早期乳腺癌筛查的数据有限，部分原因是早期疾病的低肿瘤负荷使ctDNA血液浓度极低，因此检测困难。现有研究发现乳腺癌患者ctDNA浓度与早期乳腺癌肿瘤负荷有直接关联。LEARY等［11］通过优化ctDNA检测分析方法，发现ctDNA在乳腺癌诊断中的敏感度、特异度分别为90%、99%，但该研究纳入的样本量较少，统计学上证据不足。也有学者报道ctDNA PIK3CA及TP53变异在乳腺钼靶分级为BRADS-4c/5的乳腺癌筛查中发挥一定作用［12］。本团队前期研究［13］发现HER2+乳腺癌患者ctDNA HER2拷贝数中位值为1.3（95%CI：1.2～1.36），高于健康对照组的 0.98（95%CI:0.95～1.03，P<0.01），提示ctDNA HER2拷贝数具有一定的诊断价值。此外，ctDNA甲基化水平对乳腺癌早期诊断也具有重要意义。SHAN等［14］将 SFN、P16、hMLH1、HOXD13、PCDHGB7、RASSF1a 6个基因作为乳腺癌ctDNA甲基化水平特定的筛选位点以区分健康者与乳腺癌患者，其特异度、灵敏度分别为78.1%、82.4%。另有研究联合ctDNA拷贝数变异和基因变异与ctDNA甲基化水平、蛋白质类生物标志物或其他肿瘤特异性标志物，然后通过特定的筛选算法用于早期乳腺癌诊断［15-17］。然而，目前ctDNA用于乳腺癌早期诊断的变异阈值仍缺乏统一标准，区分健康人群与肿瘤患者以及良性肿瘤与恶性肿瘤的效能存在较大差异。

3 ctDNA与乳腺癌分子分型

乳腺癌亚型依赖于癌细胞表面受体表达水平，最终由肿瘤细胞表面受体上游靶基因差异表达决定［18］。若ctDNA替代组织活检用于乳腺癌分型，必须考虑的问题是ctDNA变异与原发肿瘤基因组变异是否有较高一致性以及ctDNA变异能否准确反映不同亚型的分子特征？针对这些问题，GUAN等［19］研究纳入105例不同亚型乳腺癌患者，发现在抗肿瘤治疗前HER2基因扩增在ctDNA与原发灶肿瘤组织中的一致率达86.5%，诊断HER2表型的阳性预测值为94.9%，证实ctDNA在乳腺癌分子分型诊断中的应用潜力。SHATSKY 等［20］在 TP53、PIK3CA 和 ESR1基因突变的乳腺癌以及RIVIERE等［21］在胃肠道恶性肿瘤研究中也获得了类似的一致率。以上研究结果表明ctDNA变异与组织DNA变异的一致性较好，能够较好地反映肿瘤组织DNA特征，有望替代组织活检。然而，目前检测流程中如样本提取、储存和检测方法以及数据分析等环节仍缺乏统一标准，这在一定程度上限制了ctDNA检测在临床上的应用。CHAE等［22］利用两种不同的第二代测序平台（Foundation Medicine和Guardant360）对45例乳腺癌患者ctDNA和配对组织DNA进行测序分析，发现当考虑所有检测基因时（包括未发生突变的基因），ctDNA变异与组织DNA变异的一致率为91.0%～94.2%，但当只考虑肿瘤相关基因时两者的一致率仅为10.8%～13.8%，拷贝数变异的一致率更低，仅为3.5%，因此认为不同检测技术及数据分析方法会导致结果出现较大差异。

尽管如此，目前也有越来越多的证据表明ctDNA检测可用于区分乳腺癌的不同亚型。YI等［23］发现不同亚型的晚期乳腺癌患者ctDNA在基因变异方面具有明显不同的特征：FGFR1基因拷贝数变异（CNV）及点突变、NOTCH3点突变和ESR1点突变只能在ER+组中被检测到，且该组中PIK3CA突变频率高于ER-组（40.00%vs 17.14%）；与 HER2+组相比，NOTCH1基因在HER2-组中的突变频率更高（15.63%vs2.94%），而ERBB2基因CNV及点突变只在前者中被发现；且三阴型乳腺癌ctDNA中检测出的癌症相关基因数量在4种亚型中最多。ZHOU等［24］也发现不同亚型乳腺癌患者ctDNA的检出率存在差异，HER2过表达与ctDNA中ERBB2基因扩增呈正相关，提示ctDNA中ERBB2基因扩增可能成为乳腺癌HER2+组与其他亚型区分的检测靶标。以上研究说明，ctDNA变异在不同亚型之间的差异能为乳腺癌分子分型提供鉴别价值，未来有可能成为一种快捷高效、可重复的检测手段。但目前相关研究仍较少，ctDNA与乳腺癌分子分型的相关性可作为下一步的研究方向。

4 ctDNA与乳腺癌新辅助治疗疗效的动态评估

近年来，越来越多的研究证实ctDNA可用于乳腺癌新辅助治疗、内分泌治疗及靶向治疗疗效的动态监测。一项哌柏西利和氟维司群用于治疗晚期激素受体阳性乳腺癌患者的随机Ⅲ期临床试验［25］发现，纵向分析基线、用药第1天、第15天的ctDNA PIK3CA突变水平变化可预测患者治疗后期对帕博西尼的敏感性，但ctDNA ESR1突变的动力学改变预测价值并不大。而ctDNA ESR1突变能否动态监测内分泌治疗？LI等［26］研究则得出了不同的结论，该研究通过纵向分析每3个月1次的ctDNA ESR1突变水平，发现ctDNA ESR1突变的动态变化与血液肿瘤标志物（CA153、CA125、CA199）的变化趋势及影像诊断结果（根据实体瘤疗效评价标准评估疾病进展、疾病稳定）的变化具有高度一致性，说明ctDNA ESR1突变能预测HR+乳腺癌患者内分泌治疗的耐药性。此外，该研究还观察到不同类型的ESR1突变在治疗过程中表现为依次获得，这可能反映了肿瘤内部的异质性以及内分泌治疗压力下ESR1突变的选择性演变，也说明在内分泌治疗过程中ctDNA动力学改变能显示出肿瘤亚克隆对治疗的不同反应。

关于靶向治疗方面，GUAN等［19］纳入31例HER2阳性乳腺癌患者，对其靶向治疗过程中的ctDNA HER2拷贝数进行动态监测，发现治疗基线时HER2扩增水平与经数个用药周期后相比明显降低，CT扫描检查显示疾病出现进展时，配对的ctDNA HER2拷贝数也明显上升，可见ctDNA HER2扩增随靶向治疗效果波动，尤其治疗6周后HER2扩增持续阳性者无进展生存期明显减少。本团队前期的一项研究［13］纳入30例曲妥珠单抗联合新辅助化疗的HER2阳性乳腺癌患者，动态监测了患者的ctDNA HER2拷贝数，结果显示治疗前后HER2拷贝数明显下降，且病理完全缓解与HER2拷贝数有关。RIVA等［27］纳入38例接受新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NCT）的三阴型乳腺癌患者，纵向分析NCT前、第1周期前、手术前以及手术2～10周后4个时间点的ctDNA含量变化，发现ctDNA含量与NCT过程中的肿瘤负担呈正相关，说明ctDNA在三阴型乳腺癌的NCT过程中对监测其肿瘤进展具有一定潜力。

综上可见，目前的研究显示了ctDNA连续监测在乳腺癌患者新辅助治疗中的积极意义，但新辅助治疗早期ctDNA变异或任何时间点的ctDNA变异能否预测肿瘤对药物的反应及耐药性仍需大样本的前瞻性研究及长期临床随访证实。

5 ctDNA与乳腺癌微小疾病残留及不良预后

既往研究以证实微小疾病残留（minimal residual disease，MRD）与乳腺癌复发和不良预后密切相关［28］。现越来越多的研究也已证实ctDNA在早期发现MRD及评估预后的实用性。CIRMENA等［29］从治疗基线开始，对10例乳腺癌患者的治疗全过程进行了长达2年的多时间点连续跟踪随访，并对ctDNA进行标记靶向深度测序（tTDS），证实了ctDNA追踪在检测MRD和预后评估中的潜在临床价值。预测复发方面，GARCIA-MURILLAS等［30］开展的前瞻性队列研究共纳入55例接受NCT的早期乳腺癌患者，检测术后早期（第2周及第4周）及每隔6个月采集点的ctDNA，结果发现ctDNA的靶向捕获测序分析可确定是否存在MRD，从而较好地预测转移性复发，且相较于临床常用监测方法其预测时间平均提前了7.9个月。OLSSON等［31］也报道ctDNA预测乳腺癌复发的时间平均提前了11个月，还发现术后ctDNA的检出与较短的无病生存期（disease free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）有关。此外，多项研究也已证实ctDNA预测复发具有较高准确性［32-33］。然而，近年来尽管ctDNA捕获及测序技术不断优化，但其特异性靶向捕获探针的设计复杂，因此ctDNA检测的灵敏性和特异性并不理想，从而限制了ctDNA在监测MRD及预后评估等方面的应用。

6 小结

乳腺癌已进入分子分型指导下的个体化诊疗时代，与经典的组织活检和传统的影像学方法相比，ctDNA检测具有简便、无创、实时动态、可重复性等优点，能更全面、灵活、动态地反映肿瘤的演变过程。采用新一代测序技术进行ctDNA高通量检测，并对检测技术进行标准化后有望替代传统的组织活检，为乳腺癌的早期诊断、个体化治疗、预后判定等提供简便、特异、微创的检测手段。同时也应该看到，尽管ctDNA检测技术的迅速发展已经极大地提高了ctDNA的检测效率，但是各检测环节的处理标准仍不规范，其临床实用性也仍需大规模的基础实验和临床研究证实，才能真正为乳腺癌患者的个体化精准诊疗提供服务。