颗粒酶A 在肿瘤免疫中的功能研究

顾亚茹 郭长缨*

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京211198）

颗粒酶属于丝氨酸蛋白酶家族，在人类中，主要表达了五种颗粒酶（GzmA，GzmB，GzmH，GzmK 和GzmM），颗粒酶的氨基酸序列具有约40%的同源性，显示相似的胰蛋白酶样结构，并共享催化三联体残基His，Asp 和Ser[1]。20 多年来，穿孔蛋白和颗粒酶一直被认为是细胞毒性T 细胞(Tc)和自然杀伤(NK)细胞在癌症免疫监测中发挥关键作用的执行者[2]。

1 GzmA 结构

目前已经得到关于颗粒酶A 高分辨率的晶体结构[3-4]。GzmA形成稳定的二硫键连接的同型二聚体，并以不依赖caspase 的方式触发靶细胞死亡[5]。由于GzmA 单克隆抗体不能识别pro-GzmA，因此，活化后的颗粒酶A 可能发生了构象的改变[6]。已有实验验证，当把核裂解物与胰蛋白酶一起孵育过夜时，大多数蛋白质会降解。但是，在与相似浓度的GzmA 孵育过夜后，大多数蛋白质条带保持不变[7]。因此，GzmA 的结构决定了它对底物的高特异性。

2 GzmA 合成、加工、传递过程的细胞生物学活性

在颗粒酶的合成，加工和存储过程中，有几种机制可确保它在杀伤细胞内没有活性，以保护其不破坏宿主细胞。所有颗粒酶均被合成为无活性的前体分子，前体包含将其引导至内质网（ER）的信号序列和N 端二肽，N 端二肽仅在细胞毒性颗粒中被组织蛋白酶C（二肽基肽酶I）去除，使GzmA 从无活性状态转变为成熟的有活性的颗粒酶A[8]。当杀伤细胞与靶细胞结合而被激活时，细胞毒性颗粒向免疫突触移动，细胞毒性颗粒膜与杀伤细胞质膜融合，将颗粒内容物释放到免疫突触中[9]。在靶细胞与CTL 细胞之间的免疫突触中释放出颗粒内容物后，颗粒酶借助穿孔素进入靶细胞，特异性切割各种蛋白底物[1]，发挥免疫效应。

3 GzmA 的抑制剂

内源性抑制剂对蛋白水解酶的调节对于维持体内稳态和防止不良损害至关重要。尽管细胞毒性T 细胞内的颗粒酶转运机制最大程度地减少了活性酶从颗粒中的泄漏，但是仍然会有漏网之鱼可能导致细胞死亡[10]。所以一个重要的问题是CTL 如何保护自己免受细胞毒性分子的侵害？

第一种保护机制是在颗粒融合过程中将能够将蛋白水解灭活穿孔素的细胞毒性颗粒膜蛋白（组织蛋白酶B）外化到杀伤细胞质膜上。第二种是是杀伤细胞表达丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制剂是一个大的蛋白酶抑制剂家族，可以通过共价和不可逆方式地结合到酶活性位点上使其靶向失活[11]。第三种颗粒酶A 抑制剂是胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂（PSTI）[12]，在患有炎症和组织破坏的患者的血液中被发现（124,125）。除此之外，还有几类合成的外源性抑制剂，包括异香豆素衍生物，肽氯甲基酮和肽膦酸酯（121）也是研究和潜在治疗应用的有力工具。

4 GZMA 对肿瘤的调控机制

细胞毒性T 淋巴细胞和自然杀伤细胞是人体持续防御病毒感染和肿瘤发展必不可少的因素，主要通过两条途径杀死感染或异常的靶细胞，将一系列颗粒酶引入靶细胞，或通过TNF 超家族依赖性杀伤。在依赖颗粒酶的杀伤过程中，由多种颗粒酶介导，使靶细胞快速有效的死亡[13]。GzmA 可能通过多种途径促进靶细胞死亡，但内质网相关的SET 复合物组分的蛋白水解被认为是该颗粒酶导致细胞死亡的主要机制[14]。GzmA 对含有SET（也称为HLA 相关蛋白II 或PHAPII），PHAPI（pp32，富含亮氨酸的酸性核蛋白）和HMG2 的270-420 kDa 的高分子蛋白复合物进行水解，可释放NM23-H1（一种依赖Mg2+的DNase），导致核DNA 单链断裂[5]和其他凋亡特征，包括核碎裂、染色质凝聚、线粒体电位丧失和膜起泡等[15]。

5 GZMA 促炎作用

尽管有关GzmA 的大多数文献都集中于其在细胞死亡中的作用，但是首先发现的GzmA 的底物是白介素（IL）-1β[16]。GzmA激活该关键促炎细胞因子，暗示着GzmA 可能在炎症调节中起着重要的作用。越来越多的证据表明颗粒酶调节炎症，促进单核细胞和巨噬细胞分泌促炎因子[17]。因此，除了作为细胞死亡效应分子传递到靶细胞外，颗粒酶还可能具有释放到细胞外空间的活性。目前已知，有感染性疾病和炎性疾病的患者胞外颗粒酶A 水平升高。例如类风湿性关节炎、败血症以及病毒或细菌感染的患者滑液、血浆，血清或支气管肺泡灌洗液中的颗粒酶水平升高[18-20]。GzmA 还可以增强人单核细胞TLR 信号传导和细胞因子的释放。但是目前其促炎因子释放的分子机制仍然未知[21]。

6 讨论

分子、结构和细胞生物学的相关研究进展增强了我们对GzmA 的功能性研究。为了了解对各种炎症和肿瘤疾病的易感性，穿孔素- 颗粒酶途径的研究越来越多，希望能在有关免疫系统如何杀死肿瘤细胞以及肿瘤内炎症方面有更多的了解，使得免疫疗法效果得到进一步提高。

根据目前研究结果发现GzmA 除了在免疫细胞中表达并发挥抗肿瘤功能外，在肿瘤细胞中也有微量存在。但是是否所有肿瘤细胞中GzmA 都表达，以及发挥什么样的生理功能仍然是未可知的，因此，在GzmA 与肿瘤的相关研究方面还有许多问题亟待解决。