新型瘦肉精西马特罗胶体金快速检测卡的制备

李 鹏1 郭 燕 矫胜田

1.中国动物疫病预防控制中心 北京 1001252.新疆克拉玛依市场监督管理局 新疆克拉玛依 834099

西马特罗属于肾上腺素受体激动剂(β兴奋剂)，是一种新型的“瘦肉精”。有研究表明饲喂西马特罗等瘦肉精，可以增加肥育猪、牛、羊等饲料报酬和瘦肉率[1～3]，达到促进家畜生长、改善肉质的效果。但同时也会在食源性动物体内蓄积残留。食用含有瘦肉精的猪肉对人体有害。国家农业农村部曾多次发文规定，严禁在饲料、动物饮用水、所有动物食品，以任何用途使用西马特罗，并规定西马特罗为禁止使用的兽药，在动物性食品中不得检出。

目前检测瘦肉精的检测方法众多，主要包括色谱技术[4]和免疫分析技术[5，6]。高效液相色谱法灵敏度高、选择性好，但技术要求高、仪器昂贵，且不适合现场快速测定。胶体金免疫层析技术可快速、准确检测出食品中有害有毒物质残留，操作方法简单、便于现场检测，现已广泛应用于食品安全检测领域。

本研究对新型瘦肉精Cimaterol西马特罗胶体金检测的工艺流程进行优化，摸索胶体金检测卡制备的最适条件，提高西马特罗快速检测卡质量，并实现快速、准确现场检测西马特罗，同时也为基于胶体金技术的其他检测产品的研究与探索提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 实验材料

氯金酸，购自国药集团；

西马特罗单抗自行研制，西马特罗抗原购自上海金标；

西马特罗标准品，购自北京中科质检生物；

胶体金耗材套装，购自上海杰一生物；

羊肉、牛、猪肌肉组织样品、尿样，采自本地屠宰场。

1.1.2 实验仪器

XYZ HM3030喷金划膜仪(上海金标)；

WM-100切条机(上海金标)；

台式高速冷冻离心机(SIGMA)；

紫外可见分光光度计(上海光谱仪器)。

1.2 方法

1.2.1 金标垫的制备

用1.35%红色金颗粒标记取1mL胶体金溶液于2mL试管中，加入0.2M K2CO32.0μL/mL，混匀；加入抗体原液1.0μL，混匀后静置5min；加入封闭液10μL/mL(10%BSA)，混匀后静置5min；4℃，12 000r/min离心，5min；1/20体积的复溶液复溶，喷涂于已封闭好的玻璃纤维素膜上，迅速转移至冷冻干燥机内进行冷冻干燥，制作成为金标垫。

1.2.2 样品垫和吸水垫的制备

样品垫为玻璃纤维素膜浸没入封闭液(含有2%～3%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸缓冲液)进行封闭，37℃干燥备用。吸水垫为吸水性能较好的吸水滤纸材料。

1.2.3 硝酸纤维素膜(NC膜)的包被

用包被液将制备的人工西马特罗抗体，稀释50倍作为T液；PC-2羊抗鼠单克隆抗体，稀释250倍作为C液。将制备的C液及T液分别在NC膜上划线，从左至右顺序依次为T液和C液，置37℃干燥20～40min，干燥后浸没入封闭液封闭，置于37℃恒温箱中干燥备用。

1.2.4 检测卡的组装

将制备好的样品垫、金标垫、NC膜以及吸水垫裁剪为宽度相同的长方形，把人工抗原用包被液50倍稀释后，用移液器点1μL于空白NC膜上，背板一端贴上吸水纸，另一端贴上处理后的金标垫与样品垫，辅料之间相互连接，两端均压NC膜1～2mm，切成3.5mm宽的条子，组装成检测西马特罗含量的检测卡。

2 结果与分析

2.1 胶体金快速检测卡pH的优化

用1.35%的红色金颗粒标记，0.2mol/L的K2CO3分别添加1.5、2.0、2.5、3.0μL/mL，抗体标记量为5μL/mL，每个条件标记1mL，10%BSA封闭，复溶液复溶至100μL，备用。检测结果如附图1所示，结果显示K2CO3加2μL/mL时效价最好。

图1 pH的优化结果

2.2 抗体标记量的优化

在上述标记条件下，抗体标记量调整为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μL/mL，检测结果如附图2所示，结果显示抗体标记量在1.5μL/mL时显色最好。

图2 抗体标记量优化结果

2.3 西马特罗胶体金快速检测卡灵敏度测试

通过使用研制的西马特罗胶体金，快速检测卡对含有西马特罗的样品进行检测，结果如附图3所示。检测结果显示，所获得的西马特罗胶体金快速检测卡灵敏度达到0.1ppb，通过调试产品达到检测需求。

图3 西马特罗胶体金快速检测卡灵敏度测试

2.4 西马特罗瘦肉精检测卡性能验证

2.4.1 灵敏度和重复性检测

灵敏度和重复性检测见表1。

表1 西马特罗检测卡灵敏度检测的T、C线显色结果表

注：“+”为显色、“-”为不显色、“+/-”为显色不清晰。

表1结果显示，当西马特罗标准液浓度达到0.1ng/mL时T线不显色，为阳性；随着标准品浓度的增加T线不显色，C线颜色增深，表明西马特罗瘦肉精检测卡的最低检测限为0.1ng/mL。西马特罗试纸条加入阴性PBS后，T、C显色清晰，阳性样本西马特罗标准液加入后的检测结果如表1所示，检测卡的批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0%(见表2)。

表2 试纸条重复性的检测

2.4.2 特异性检测

为了验证研发的西马特罗检测卡的特异性，我们通过滴加不同浓度的常见的三种瘦肉精盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，表3的结果显示，试纸条与上述三种瘦肉精均未有交叉反应出现，表现出良好的特异性。

表3 试纸条的特异性检测

2.5 西马特罗检测卡检测应用

分别使用西马特罗检测卡和ELISA试剂盒对86份猪组织样品进行检测，结果ELISA检测出12份阳性，西马特罗检测卡检测出11份阳性，两者的符合率为91.7%。

3 讨论

养殖环节非法添加瘦肉精已经是普遍的现象，目前新型瘦肉精的不断出现给监管部门执法监管带来很大障碍，尤其是缺乏现场快速检测技术。胶体金免疫层析技术近年来发展迅速，因其操作简便快捷，特异性强，灵敏度高且便于现场操作，已广泛应用于食品安全检测领域。本研究制备的新型瘦肉精西马特罗胶体金检测卡的灵敏度为0.1ng/mL，且特异性好，与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等常见的瘦肉精均无交叉反应。而且使用方便、快速、准确，成本低，可用于西马特罗的快速检测，适合基层兽医站和养殖企业、屠宰企业、市场监管部门使用。