烷基间苯二酚分析技术及其生理活性研究进展

邹燕羽，樊凤娇，方勇，李彭，黄沁沁，汪开拓

1(重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆，404000)2(南京财经大学 食品科学与工程学院，江苏 南京，210023)

烷基间苯二酚(alkylresorciols，ARs)是WENKERT等首次在小麦、黑麦等谷物中发现的一类特殊的酚类类脂，具有两亲性[1-3]。ARs主要存在于高等植物中，如黑麦、小麦、大麦、银杏和芒果中[4-5]。另外，也少量存在于苔藓、藻类、真菌和细菌等低等植物以及真菌中[6-8]。ARs主要分布在谷物皮层，而不存在于精细制粉加工所得的谷类精制面粉或精制产品中，因此ARs可作为人体摄入小麦、黑麦等全谷物产品的生物标记物[9-10]。2015年，国家粮食和物资储备局在粮食行业标准已将ARs选为评价全麦粉品质的重要标准之一[11]。

ARs是1,3-二羟基-5-烷基苯衍生物的总称，其苯环第5位上主要由奇数个碳烷基侧链取代，从而形成了多种ARs同系物，如5-十七烷基间苯二酚(C17∶0)、5-十九烷基间苯二酚(C19∶0)、5-二十一烷基间苯二酚(C21∶0)、5-二十三烷基间苯二酚(C23∶0)和5-二十五烷基间苯二酚(C25∶0)等[12-14]。研究表明，谷物中的ARs同系物大多数是饱和的，不饱和的及含氧的同系物仅占0.5%～20%[15]。ARs的各个同系物的分子结构不同，不同同系物之间仅相差若干个—CH2，因此化学性质极为相似，同系物之间的极性相差较小。ARs特殊的两亲性有助于其发挥多种生理活性功能，如抗氧化、抗癌和抗肿瘤等，并对多种慢性疾病如肥胖、老年痴呆等具有一定改善作用[16-18]。ARs同系物的链长和结构对其生理活性有重要影响。因此，ARs的分离纯化及相应活性分析研究日益受到研究学者的关注与重视。

ARs作为全谷物产品中的生物标记物，在膳食营养领域具有巨大的发展潜力。同时，ARs是全谷物中的酚类物质，对人体内抗氧化、代谢和肠道保健机制的发挥具有重要意义[19]。目前，国内外学者们已对ARs开展了大量的研究，包括提取、分离、纯化以及生理活性等方面。本文主要综述ARs的分析技术及其生理活性研究，探究各个分析方法的优缺点和未来的发展方向，旨在为快速、准确地分析不同基质中的ARs提供方法参考。同时，经过系统地梳理其生理活性，本文将为ARs在慢性疾病预防方面提供方向指导，并期望进一步引起人们对全谷物食品的关注。

1 烷基间苯二酚的提取技术

1.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是根据不同物质组分在有机溶剂中溶解度的差异，将生理活性物质从原料中提取出来的方法。依据相似相溶原理，ARs能够迅速溶于有机溶剂中，有机溶剂提取法是ARs的常规提取方法。该方法操作简单，常作为首要步骤并与其他提取方法如超声索氏提取、超声或超临界萃取相结合。ARs的常用提取溶剂主要有乙酸乙酯、丙酮、正丁醇和二氯甲烷等，目前使用最多的是乙酸乙酯[20-21]。有机溶剂提取技术原理简单，对设备的要求较低，成本低廉。但是大多数的有机溶剂都具有低毒性，且易造成环境污染。因此，开发高效、低毒环保的提取ARs的方法，成为了研究热点。

1.2 超声辅助萃取法

超声辅助萃取法的工作原理主要是利用超声波的空化作用，使样品物料的细胞膜和细胞壁在提取过程中充分破碎，从而加快目标物质的释放与提取。同时，超声波不会对提取物的结构和活性造成影响，且对提取物中热稳定性差的活性组分的破坏性低[22]。超声波辅助提取具有速度快、得率高、温度低和能耗低等优点，在ARs的提取方面具有较强的适用性。彭田园等[17]采用超声波辅助提取手段，研究了超声功率、提取时间及料液比3个因素对ARs 提取量的影响。研究表明，该方法可大大提高提取效率，且样品用量少、重复性好，适用于全麦粉中ARs的快速提取。因此，采用有机溶剂辅助超声波萃取有助于ARs提取效率的提高。

1.3 超临界二氧化碳萃取法

超临界流体萃取法是新兴的分离提取新技术，被广泛应用于食品、医药和石油化工工业等方面[23-24]。其萃取原理是在较低温度下，通过增加设备中压力，使萃取气体转化为液体，对处于临界状态的物质进行萃取、分离和纯化，具有效率高、无残留和对目标成分损坏小等优点。超临界流体萃取法比传统萃取提取技术更具优势。超临界流体萃取法一般不选用有机溶剂，因此无有机溶剂残留和污染。提取过程温度低，能最大限度地保留活性物质的生理活性和天然风味等。同时，超临界流体萃取中的萃取流体CO2价格便宜并可循环使用。GUNENC等[25]利用极性助溶剂(10%乙醇)与非极性流体(CO2)相结合的方法提高了ARs的萃取率。虽然超临界流体萃取技术具有诸多优点，但是由于设备操作成本高，CO2需求量大，仅适用于大规模的工业生产。

2 烷基间苯二酚的纯化技术

2.1 固相萃取法

固相萃取法(solid phase extraction, SPE)通过选择性吸附与洗脱对样品进行富集、分离净化，是在液固萃取和液相色谱柱技术基础上产生的一项前处理方法。与传统的液液萃取相比，固相萃取具有简便、高效、低能耗等特点，在样品前处理中发挥着重要作用[26]。固相萃取小柱是利用固相萃取的原理衍生出来的商业产品，已被广泛运用到实验室的研究工作中。根据待分析样品性质，选择不同介质的SPE小柱。常用的SPE小柱有硅胶柱、C18柱、HLB柱、阴离子交换柱和硅藻土柱等[27]。MARKLUND等利用SPE小柱对尿液进行前处理，再经过高效液相色谱-库仑电极阵列检测器和气相色谱质谱联用对ARs代谢物3,5-二羟基苯甲酸和3-(3,5-二羟基苯基)-1-丙酸进行定量，结果表明SPE小柱对待测样品具有良好的净化效果，可用于样品分析的前处理[28]。然而，选用SPE进行前处理也存在一定局限性，这可能是由于ARs是酚类油脂，在进行分析测定时，极易残留在SPE小柱上，使分析结果重现性降低，且容易引入杂质干扰后续分析结果。另外，SPE小柱容量小、价格昂贵，仅适用于ARs的分析检测而不能进行大量制备。

2.2 薄层色谱法

薄层色谱，又称薄层层析(thin layer chromatography, TLC)，能够实现微量物质的快速分离和定性分析。TLC法的原理与柱层析相同，TLC是以玻璃板上涂布的吸附剂作为固定相，再选择适合极性的溶剂作为流动相，实现对混合样品分离、鉴定和定量的目的。TLC能够快速有效地分离脂肪酸、氨基酸和生物碱等物质，从50年代发展起来至今仍被广泛采用。ARs是特殊的酚类脂质，粗提物中由多种ARs同系物组成，可以采用TLC法对其初步分离后进行定量和定性。郭亚洲采用TLC法，选用石油醚-乙酸乙酯混合溶液作为展开剂进行薄层色谱分离，根据ARs标品对应的Rf值确定麦麸中ARs的位置，成功实现粗提物的初次分离纯化[29]。PATZKE等认为ARs提取物中同时存在饱和与不饱和同系物，通过半制备液相色谱对各个ARs同系物进行单体制备难度较大，应当使用TLC法进行初分离[30]。然而，TLC法比较耗时，成本较高，且存在目标物不可逆吸附现象[31]。

2.3 硅胶柱层析法

硅胶柱层析根据待分离物与硅胶吸附力的强弱实现不同极性物质的分离。一般情况下，极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。根据待分离物极性的差异，选择不同极性的洗脱剂。待分离物极性小用乙酸乙酯和石油醚洗脱，待分离物极性较大则用甲醇和氯仿洗脱。经过吸附、解吸、再吸附、再解吸的层析过程，即可实现样品的分离。LIU等利用硅胶柱层析，选用氯仿-乙醚混合溶液为洗脱液分离纯化得到ARs同系物[32]。WANG等以相同的方法，将硅胶柱层析分离纯化得到的小麦ARs运用到氧化损伤的人视网膜细胞保护作用的研究中[33]。

经比较3种纯化方法的优缺点后，在我们之前的实验中，采用硅胶柱层析对ARs乙酸乙酯粗提物进行纯化，成功获得ARs纯化物。经结构鉴定，可知ARs纯化物中仅含7种同系物，且纯度和分离度较高。实验表明，硅胶柱层析能够有效地除去ARs粗提物中的其他活性成分，可以实现ARs同系物的纯化和富集。虽然使用硅胶柱层析进行样品纯化耗时较长，但其具有操作简单、适用性强、成本低廉等优点，适用于实验室大量分离纯化ARs。

3 烷基间苯二酚的检测技术

3.1 分光光度法

基于ARs与Fast Blue B盐在酸性甲醇中形成有色衍生物，可以通过分光光度法测定ARs的含量[34]。该方法简单、快速和足够灵敏，可用于ARs的分析研究。在色谱法发展之前，分光光度法已被广泛应用于ARs的定量研究中。SAMPIETRO等对传统的分光光度法进行改良，提出使用Fast Blue RR重氮盐取代Fast Blue BB盐，开发了一种新的、可量化小麦和黑麦谷物及其麸皮或全谷物产品中ARs的微量比色法[35]。该方法显色反应的灵敏度和稳定性均得到显著提高，可被运用到ARs的定量研究中。2015年，国家粮食行业LST 3244—2015中制定了有关全麦粉中ARs的测定方法。该行业标准利用显色反应的原理，选用Fast Blue B盐，采用分光光度法测定谷物中ARs的含量[9]。虽然此方法对微量的间苯二酚具有较高灵敏度，但也存在一些不足之处。LANDBERG等在比较气相色谱法和比色法测定谷物及其制品中的ARs时发现，分光光度法测定的ARs含量高于气相色谱法，这可能是由于Fast Blue盐会与其他酚类化合物发生反应[36]。同时，分光光度法只能实现ARs的定量，无法区分样品中ARs的同系物组成，因而该方法在ARs同系物的研究中存在一定局限性。

3.2 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法(gas chromatography - mass spectrometry, GC-MS)是在将气相色谱和质谱检测结合起来的综合性分析技术,既具有气相色谱分离效率高、分析简便等特点，又具有质谱技术的高鉴定判别能力,因此，该方法被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，可适用于多组分和未知组分的定性定量分析，是生物样品中药物与代谢物定量、定性分析的有效工具。2001年，ROSS等选用脂肪酸甲酯作为内标，通过气相色谱分析黑麦籽粒ARs提取物，建立了一种快速简便分析黑麦籽粒中ARs的方法。通过气相色谱/质谱法鉴定ARs，发现主要同系物含有C17∶0，C19∶0，C21∶0，C23∶0和C25∶0[37]。在此研究基础上，ROSS等对烘焙后的谷物产品中ARs进行测定，研究发现高温烘焙后，ARs未被破坏，证明ARs可耐高温具有稳定性[38]。另一方面，MARKLUND等发现该方法适用于血液和尿液中ARs的分析测定[39-40]。ROSS等采用GC-MS对食用藜麦受试者血浆进行检测，发现ARs可作为人体摄入藜麦的生物标记物[41]。

3.3 高效液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱-质谱联用法(high performance liquid chromatography - mass spectrometry, HPLC-MS)是将高效液相色谱和质谱检测结合起来进行分析和鉴定的技术。该方法高效快速、灵敏度高，样品预处理简单，适用于含量低、不易分离样品的检测分析，已被广泛应用于天然产物的定量和定性分析的研究中[42-43]。MULLIN等对比了荧光测定法、气相色谱分析和HPLC法这3种测定方法，研究结果表明，在定量方面HPLC法是最准确的分析方法[44]。在此基础上，前人将其与质谱技术联合起来，运用于ARs的定量和定性分析中。由于ARs在280 nm处具有明显的吸收峰，结构中含有的不同类型基团，当处在电喷雾和大气压化学源等离子源作用条件下，会发生离子化裂解而形成不同分子质量的特征碎片。通过对质谱多级碎片的特征结构分析，能迅速对ARs进行结构鉴定。KNODLER等采用HPLC-MS技术并结合固相萃取的样品前处理技术测定表征了芒果皮中ARs，并且该方法被用于不同基质中ARs的测定和结构表征[45]。ROSS等利用HPLC-MS技术检测人体血浆中的ARs。采用该方法，无需对样品进行固相萃取或化学衍生，可大大提高实验室检测分析的效率，并降低了实验室消耗成本[46]。

综合分析比较3种检测方法后，在我们课题组的研究中(未发表)，采用HPLC-MS技术对硅胶柱层析所得的ARs纯化物进行结构鉴定，实验表明ARs纯化物中含的7种同系物，分别为C17∶0、C19∶1、C19∶0、C21∶1、C21∶0、C23∶0和C25∶0。

4 烷基间苯二酚的生理活性研究

4.1 抗氧化活性

ARs的分子结构与生育酚的分子结构相似，其间位含有2个羟基，可以给出质子清除氧化自由基，具有抗氧化活性[47]。与生育酚相比，ARs的抗氧化活性较弱，在相同浓度下，生育酚的抗氧化活性CARs同系物C15∶0高大约10倍。然而，在生物膜的氧化性研究中，ARs展现出了很强的抗氧化特性[48]。ARs长链能够插入细胞膜中，通过氢键相互作用与磷脂结合形成低聚物和聚合物复合物，从而引起双层结构和性能的改变，发挥生物膜的保护作用[49]。同时，ARs可以抑制脂质的过氧化，进而调节生物膜中油脂的氧化反应，维持膜屏障功能稳定达到抗氧化目的[50]。ZUBIK等研究发现长链ARs同系物可以有效抑制Fe2+诱导的脂质体膜中脂肪酸和磷脂的过氧化，以及甘油三酯和脂肪酸的自氧化[51]。KOZUBEK等研究发现黑麦ARs对H2O2诱导的红细胞膜脂质氧化具有保护作用[52]。WANG等研究了小麦ARs对人视网膜色素上皮细胞氧化应激的保护作用及其可能机制，实验结果表明ARs能够显著降低过氧化氢诱导的活性氧水平，增加抗氧化反应基因GCLM、GCLC、NQO1和HO-1的转录和蛋白表达，通过Nrf2/HO-1信号通路保护ARPE-19细胞免受氧化应激诱导的细胞损伤[33]。另外，谷物ARs的抗氧化特性可以保护食品在加工和贮藏过程中的品质安全。由于ARs几乎不存在于精细面粉或精加工谷物产品中，因此全麦面包的货架期会比精细小麦粉制作的面包具有更长的货架期[53]。因此，作为一种天然抗氧化剂，ARs在食品工业和生理活性研究方面具有潜在的重要性。

4.2 降低糖尿病风险

随着人们生活方式的改变，糖尿病的发病率日益攀升，且呈现年轻化的趋势[54]。流行病学研究表明，摄入全谷物产品可以提高人体对胰岛素的敏感性，并可在一定程度上控制体重并降低患糖尿病的风险[55-56]。脂代谢异常会使血浆中游离脂肪酸水平升高和脂肪沉积，导致糖尿病的发病率上升。长期摄入高含量的ARs能够有效抑制激素敏感脂肪酶与其他脂肪酶的活性，能够减少体内脂肪的分解和降低血浆中游离脂肪酸的水平，进而降低患糖尿病的风险[57]。同时，ARs的摄入量与患糖尿病风险之间具有相关性。BISKUP等研究发现人体摄入全谷物食品后，血浆中ARs的浓度水平会升高，血浆中ARs同系物C17∶0/C21∶0的大小与患糖尿病的机率呈反比[58]。

4.3 抑制肥胖的发生

当今社会，肥胖问题已经成为人们日益关注和讨论的话题。我国的肥胖问题已初见端倪，肥胖给人们带来的健康问题，已经上升到社会和经济层面[59]。预防超重和肥胖现象已成为关乎所有国民身体素质的重大公共卫生问题[60]。流行病学研究表明，全谷物的摄入可以降低肥胖的风险。OISHI等研究麦麸ARs对饮食诱导的肥胖小鼠代谢紊乱的影响发现，ARs可有效抑制肠道对胆固醇的吸收，使得血液中胆固醇的浓度降低[61]。ARs可以通过上调肝脏胆固醇合成基因的表达，提高粪便中胆固醇的排泄率从而抑制肝脏脂质在体内的积累。同时，ARs可有效提高小鼠日内的葡萄糖耐受性和对胰岛素的敏感性，从而降低由饮食引起的肥胖率。另外，在体外活性实验中发现，ARs对脂代谢的影响主要是通过抑制脂质代谢酶的活性来实现的，如甘油-3-磷酸脱氢酶[62]，生育酚-ω-羟化酶[63]和α-葡糖苷酶[64]等。当体内的脂质代谢酶被抑制后，机体的新陈代谢速度加快，脂肪积累量减少。同时，身体对食物中碳水化合物消化率降低，防止由于碳水化合物转化为脂肪而引起的肥胖。

4.4 预防结肠癌

ARs是麦麸中预防结肠癌的主要生理活性成分，可以通过抑制细胞凋亡来抑制癌细胞的生长。杨春等研究发现ARs可通过增强Bax、PARP1和Caspase3表达，抑制BCL2表达和促进Bax/BCL2的表达，从而诱导人结直肠细胞HT29及HCT116的凋亡，对人结肠癌的防治具有重要意义[65]。FU等进一步研究ARs的抗结肠癌作用机制，研究发现ARs可激活人体抑癌基因p53的表达和降低癌基因Mdm2的表达水平，激活癌症细胞死亡中涉及的多种细胞效应，如抑制蛋白酶体和线粒体凋亡通路以及调节细胞周期，从而发挥抗肿瘤作用[66]。另外，研究表明，ARs可以降低结肠癌细胞排泄物的毒性作用，从细胞代谢环境的角度降低结肠癌细胞的增殖率。同时，ARs能够加速细胞代谢过程中产生的具有遗传毒性细胞的凋亡，从而抑制癌细胞的增殖[67]。

4.5 神经保护作用

神经退行性疾病是全世界老年人死亡的主要慢性疾病之一。神经退行性疾病是脑部神经元变性或死亡导致的慢性进行性中枢神经疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等[68]。神经退行性疾病的主要临床表现为认知功能障碍、运动功能障碍和和免疫炎症等[69]。大量研究结果表明，氧化应激通常伴随着大量活性氧的产生，是神经退行性疾病的主要发病原因。而大脑自身抗氧化能力较弱，生理活动活跃需要大量氧供给，使大脑比其他器官更易受到氧化应激的影响[70]。前人研究发现，天然产物可以作为靶点药物调节酶和受体的活性，从而预防退行性神经疾病[71]。然而，国内外关于ARs在神经保护作用方面的研究较少。ARs是一种两亲性酚脂物质，具有良好的膜渗透能力，能够进入神经元细胞，到达目标靶点清除自由基发挥神经保护作用。本课题组前期(未发表)研究采用H2O2诱导的HT22细胞构建神经元氧化损伤模型，结果表明ARs可以降低乳酸脱氢酶泄露率、膜脂质过氧化物含量、活性氧和细胞凋亡率，提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，并通过Nrf2-ARE信号通路降低氧化应激对HT22细胞的氧化损伤。因此，我们可以推断ARs可作为神经保护剂。在今后的研究中，仍需要进一步深入研究ARs对氧化应激导致的神经退行性疾病的保护机制。

5 结论与展望

ARs是人体摄入全谷物产品的生物标记物，也是一种很好的天然功能食品添加物，在评价全谷物产品质量以及营养功效方面具有重要作用。然而，目前国内对ARs的研究还处于起始阶段，主要表现在几个方面：(1)ARs的提取方法大多还采用有机溶剂法，尚缺乏绿色、高效的提取技术；(2)ARs的研究主要集中在谷物产品中定量和定性研究中，对其理化性质和结构特征尚不清楚；(3)ARs的生理活性研究多局限于体外模型，体内活性的研究较少，且暂未研究各同系物与其活性之间可能存在的关系；(4)ARs未能应用到食品工业上，导致大量麦麸未能得到合理的利用，从而造成自然资源的浪费。在今后的研究中，应当重视开发快速、高效的ARs检测方法，尤其是对ARs各同系物单体制备技术的研究，进而有助于深入探究其结构和功能特性之间的关系。同时，扩大其在食品工业上的应用范围，提高谷物副产物的利用度和经济效益。此外，ARs生理活性方面的研究，应扩大筛选范围，确定几种典型的生理活性作用。再进一步深入到ARs的体内活性研究上，探究ARs在体内的生物转化关系和作用机理，以期发掘其在膳食营养和疾病预防方面的重要作用。