高效液相色谱法测定保健品中维生素D含量

□ 罗 骁 吴帅龙 李彩玲 广电计量检测（合肥）有限公司

维生素D3与维生素D2为脂溶性维生素，主要功用是调节细胞生长分化和人体免疫功能，有利于新骨生成和钙化，促进骨骼生长[1]，预防骨质疏松症。但维生素D摄入过多，可引起高血钙、甚至软组织异位骨化等[2]。因此准确、方便测定保健食品中维生素D3的含量有着重要意义。

维生素D的分析多采用高效液相色谱法（HPLC—UV）和液相色谱—质谱法。其中高效液相色谱法需要在酶解皂化反应后，采用正相色谱净化测定，前处理复杂、费时；液相色谱—质谱法具有高灵敏度、高通量及高选择性等特点，但设备和试剂价格昂贵，影响其推广使用。本文使用维生素D2为内标，高效液相色谱法测定保健品中维生素D3，测定维生素D2时，使用维生素D3为内标，无需色谱净化，简化了操作步骤，维生素D2替代昂贵的同位素内标，降低基质效应，提高了定量准确性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电子天平（十万分之一，Mettler—Toledo），高效液相色谱仪（LC—20A，二极管阵列检测器，Shimadzu）。

维生素D2（BePure，98.0%±2%），维生素D3（BePure，99.3%±1%），抗坏血酸（山东西亚，GR，99.5%），正己烷石油醚（30～60 ℃），无水硫酸钠，甲醇，淀粉酶（活力单位≥100 U/mg）。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇+水=95+5；流速：1 mL/min；

柱温：35 ℃；检测器波长：264 nm；进样体积：50 μL。

1.3 标准品配制与样品处理

称取维生素D2、维生素D3标准品各10.0 mg，乙醇溶解定容至100 mL，浓度为10 μg/mL，并转移至棕色试剂瓶待用。用流动相配制系列维生素D3工作标准溶液，分别加入0.05 mL维生素D2标准溶液，95%的甲醇定容至10 mL。

维生素D易于被氧化，样品处理过程对分析结果的准确性有决定性影响[3]。参照《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》（GB 5009.82—2016）第四法，准确称量某品牌保健食品（片剂，打磨成均匀粉状，过筛）5.000 g试样于平底烧瓶中，加入温水和1.00 mL浓度为1 μg/mL的维生素D2标准溶液和1 g淀粉酶，60 ℃恒温水浴振荡40 min，酶解液中依次加入1.0 g抗坏血酸、0.1 g BHT、30 mL无水乙醇、20 mL氢氧化钾溶液（50%），65 ℃回流皂化50 min，用20 mL×2石油醚萃取，合并醚层。水洗醚层至中性，经无水硫酸钠过滤，旋转蒸发至约2 mL，40 ℃水浴氮吹至干，加入1.0 mL甲醇溶解，微孔滤膜过滤，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 线性范围与定量限

用加入了0.5 μg维生素D2（维生素D3）作为内标的系列浓度维生素D2（维生素D3）标准溶液上机测定；内标法绘制标准曲线。同时，取空白样品，按“1.3”方法处理后，添加维生素混合标准溶液，以3倍信噪比（S/N=3）确定其检出限，10倍信噪比（S/N=10）确定其定量限。维生素D的线性回归方程、相关系数（r2）、线性范围及检测低限结果见表1。

表1 线性方程、相关系数（r2）及定量下限

实验结果表明，此方法条件下，维生素D2、D3的分离度达到1.5，在0.01～5.0 μg/mL范围内具有良好的线性，相关系数（r2）均大于0.99，定量限＜1.0 μg/100 g。灵敏度较高。

2.2 精密度与准确度

使用厂家提供的空白样品，依据一般市售保健食品中维生素含量，设定维生素的低、中、高3个维生素D2、D3添加水平分别为：80 μg/100 g、160 μg/100 g、240 μg/100 g， 做 加标回收实验，重复实验6次，同时考察相对标准偏差（RSD），结果见表2。

实验结果表明，维生素D2、D3回收率在96.23%～104.26%，RSD为2.82%～5.10%。方法的精密度与准确度满足定量分析要求。

2.3 实际样品检测

对7种市售称有增加骨密度作用的保健品（片剂）中的维生素D3进行测定，

表2 维生素的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

VD3含量分布在67.53～172.42 μg/100 g。

3 结论

实验建立了液相色谱—紫外检测器，内标法检测保健食品中维生素D2、D3含量的方法，两者分离度达到1.5在0.01～5.0μg/mL浓度范围内有良好线性，加标回收率为97.77%～106.56%。当取样量为5.000 g时，维生素D2、D3的定量限分别为0.65 μg/100 g、0.57 μg/100 g，满足保健品中维生素D定量分析要求。