清金理嗽丸中苦杏仁苷等7 种成分的HPLC 一测多评法

林维娜，陈海燕

江南大学附属医院1 药学部；2 药检科，无锡 214041

清金理嗽丸收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第10 册，本方共由12 味药材组成，主要用于肺热咳嗽、痰多、气急呕吐、口燥等症的治疗。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）[1，2]利用中药制剂所含成分间的内在函数关系，通过测定一个质量相对稳定、易得的成分，实现方中多个成分的同时测定，具有操作简便、高效、实用性强、检验成本低等优点。本文以黄芩苷为内参物，建立其与苦杏仁苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素的相对校正因子，通过相对校正因子耐用性考察和对待测成分色谱峰的定位，同时采用一测多评法计算值与外标法实测值的对比，验证了此一测多评法能同时测定清金理嗽丸中苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素的含量，为提升清金理嗽丸质量提供参考。

1 材 料

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；MS205DU 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 药品与试剂

苦杏仁苷对照品（纯度88.2%，批号110820-201808）、黄芩苷对照品（纯度95.4%，批号110715-201821）、汉黄芩苷对照品（纯度98.5%，批号112002-201702）、黄芩素对照品（纯度97.9%，批号111595-201808）、橙皮苷对照品（纯度96.2%，批号110721-201818），均由中国食品药品检定研究院提供；芸香柚皮苷对照品（纯度99.7%，批号18071023）、川陈皮素对照品（纯度99.9%，批号18030541），均为上海同田生物技术股份有限公司产品；清金理嗽丸（每丸重3 g，批号18015602、18015116、18015660，北京同仁堂制药厂）。乙腈为色谱级，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 分别精密称取苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素对照品适量，用70%乙醇分别制成单成分储备液（经折纯计算后各成分质量浓度分别为0.592、3.536、0.704、0.358、0.412、0.474、0.132 mg·g-1），备用；依次精密吸取单成分储备液各2.0 mL，置20 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液A；再精密吸取混合对照品溶液A 各适量，依次用70%乙醇稀释2、4、8、16、20 倍，制成混合对照品溶液B、C、D、E、F，备用。

2.1.2 供试品溶液 取清金理嗽丸样品适量，剪碎，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇[2-4]25mL，称定重量，加热回流[4，5]60min，放冷，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，离心5min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按清金理嗽丸的工艺处方，分别制备缺苦杏仁、缺黄芩、缺陈皮枳壳的阴性样品，再按“2.1.2”项下方法制备3 种阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

采用Welch Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱[2-4]（0～11.0 min，9.0%A；11.0～17.0 min，9.0%A→15.0%A；17.0～31.0 min，15.0%A→38.0% A；31.0～45.0 min，38.0% A→62.0% A；45.0～50.0 min，62.0%A→9.0%A）；检测波长分别为207 nm（0～17.0 min 检测苦杏仁苷）[2]、280 nm（17.0～31.0 min检测黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素）[5]和300 nm（31.0～50.0 min 检测芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素）[5]；体积流量：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

在该色谱条件下，待测成分苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素与其他峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按各待测成分色谱峰计均不低于3500，阴性样品对待测成分的定量检测无干扰。见色谱图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围试验 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液F～A 各适量，依法进样检测，检测苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素7 个成分色谱峰的峰面积，以所测成分质量浓度c 为横坐标，峰面积A 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。见表1。

2.3.2 进样精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液B，在“2.2”项下色谱条件连续进样测定6 次，检测苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的峰面积，结果所测7 个成分峰面积的RSD 分别为0.86%、1.5%、0.61%、1.0%、0.97%、0.72%、1.2%。

2.3.3 重复性试验 取同一批次清金理嗽丸样品适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进样测定，检测苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的峰面积，采用标准曲线法计算所测成分的含量。结果所测7 个成分含量的RSD 分别为1.6%、0.49%、1.5%、0.86%、1.6%、1.7%、0.95%。

2.3.4 稳定性试验 取同一份清金理嗽丸供试品溶液，室温下放置0、2、4、8、12、16 h，按“2.2”项下色谱条件进样，检测苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的峰面积，结果表明，清金理嗽丸供试品溶液室温下16 h 内稳定，所测7 个成分峰面积的RSD 分别为0.79%、1.6%、0.66%、1.1%、0.93%、0.80%、1.2%。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批次已知含量的清金理嗽丸适量，剪碎，每份约0.5 g，取9 份，精密称定，随机分成3 组，每组3 份，分别按照样品含量的50%、100%、150%这3 个水平加入另行配制的混合对照品溶液（苦杏仁苷0.178 mg·mL-1、黄芩苷1.242 mg·mL-1、汉黄芩苷0.238 mg·mL-1、黄芩素0.102 mg·mL-1、芸香柚皮苷0.126 mg·mL-1、橙皮苷0.134 mg·mL-1、川陈皮素0.032 mg·mL-1）1.0 mL 3 份、2.0 mL 3 份、3.0 mL 2 份，再按“2.1.2”项下方法制备加样供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的峰面积，计算待测成分的加样回收率，结果平均加样回收率分别为98.65%、100.00%、99.08%、97.28%、98.29%、99.17%、97.06%；RSD 分别为1.11%、0.57%、0.93%、1.34%、1.20%、0.86%、1.56%；n 均为9。

2.4 一测多评

2.4.1 相对校正因子的计算 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液F～A 各适量，按“2.2”项下色谱条件进样检测苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的峰面积，以黄芩苷为内参物。相对校正因子计算公式：

f内/待=f内/f待=（A内c待）/（A待c内）

其中，A内为内参物黄芩苷的峰面积，c内为内参物黄芩苷的质量浓度，A待为待测成分的峰面积，c待为待测成分的质量浓度。

按公式建立苦杏仁苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的相对校正因子。见表2。

2.4.2 不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子的影响 以黄芩苷为内参物，分别考察2 种高效液相色谱仪（Agilent 1100 型高效液相色谱仪、Waters 2695型高效液相色谱仪）和3 种色谱柱（Welch Ultimate XB C18色谱柱、Agilent HC-C18色谱柱、Diamonsi C18色谱柱）对苦杏仁苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素相对校正因子的影响。见表3。

表2 清金理嗽丸中各成分的相对校正因子

2.4.3 待测成分色谱峰的定位 采用相对保留时间值对待测成分色谱峰进行定位，以黄芩苷为内参物，对比考察2 种高效液相色谱仪（色谱仪同“2.4.2”）和3 种色谱柱（色谱柱同“2.4.2”）对苦杏仁苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素相对保留时间值的影响。见表3。

表3 不同色谱仪、不同色谱柱对相对校正因子、相对保留时间的影响

2.5 清金理嗽丸含量测定中一测多评法与外标法的结果比较

取3 个批次的清金理嗽丸适量，按“2.1.2”项下方法制备清金理嗽丸供试品溶液，每个批次平行制备3 份，按“2.2”项下色谱条件，进样检测清金理嗽丸样品中苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的峰面积，先采用外标法计算上述7 种成分的含量，再按“2.4.1”项下建立的相对校正因子，根据内参物黄芩苷实测含量，计算其他6 种成分的含量。经SPSS17.0 软件、采用t 检验，分析一测多评法计算值与外标法实测值之间的差异，结果两组数据间苦杏仁苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素P 值均＞0.05，表明一测多评法计算结果与外标法实测值无明显差异，见表4。

表4 一测多评法（QAMS）与外标法（ESM）测得的清金理嗽丸中各待测成分的含量（n=3，mg·g-1）

3 讨论

3.1 待测成分的选择

清金理嗽丸由陈皮、黄芩、胆南星、枳壳、桔梗、桑白皮（制）、苦杏仁、知母（制）、麦冬、百部（制）、甘草、朱砂等12 味中药材加工而成，方中胆南星、陈皮清热燥湿化痰，为君药；黄芩、制知母清热泻火，桔梗宣肺祛痰，制桑白皮泻肺平喘，苦杏仁、制百部润肺止咳，合为臣药；枳壳理气行滞，麦冬养阴生津、润肺清心，朱砂镇惊安神，合为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药合用，共达清热、祛痰、止咳之功效。本实验参考中药质量标志物[6]以君药为主，兼顾臣、佐、使药的确定原则，选取方中君药陈皮、佐药枳壳所含主要成分芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素，臣药黄芩所含代表性成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素以及臣药苦杏仁所含代表性成分苦杏仁苷为定量测定成分，采用一测多评法实现同时测定清金理嗽丸中苦杏仁苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的含量，为全面评价清金理嗽丸质量提供数据支持。

3.2 待测成分色谱峰定位方法的选择

色谱峰的准确定位是确保所建立的一测多评法可行性的基础，通常采用相对保留时间或保留时间差对色谱峰进行定位。在本实验中，考察相对保留时间和保留时间差在2 种高效液相色谱仪和3种色谱柱中的重现性，结果保留时间差的数据波动较大，待测成分汉黄芩苷与内参物黄芩苷保留时间差的RSD＞5.0%，而相对保留时间值数据波动较小，待测成分苦杏仁苷、汉黄芩苷、黄芩素、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素与内参物黄芩苷相对保留时间的RSD 均＜2.0%。故采用相对保留时间对待测成分色谱峰进行定位。

本实验建立的方法操作简捷，重复性好，准确度高，为客观地评价清金理嗽丸的内在质量提供了较为有力的科学依据。通过方法学验证，采用一测多评法与外标法同时测定含量并将测定结果进行对比，证明了本实验方法的科学性及可行性。