矿山土壤镉污染微生物修复技术研究进展

石浩， 胡静敏， 陈忻， 彭安安

佛山科学技术学院 环境与化学工程学院，广东 佛山 528000

前言

金属矿山开采所引起的环境问题具有潜伏性、积累性和长期性。在满足资源需求的同时产生大量的尾矿，尾矿的风化、氧化及采矿废弃物处置给矿区及周边地区造成严重的重金属污染风险。其中，重金属镉(Cd)污染的问题近年来备受关注。根据2014年公布的全国土壤污染状况调查结果，我国土壤重金属污染总的超标率为16.1%，其中镉的点位超标率位居榜首，达到7.0%[1]。对全国22个省72个矿区的统计结果表明[2]，我国土壤Cd的地累积指数(Igeo)偏高，平均浓度远超我国土壤污染风险管控标准(GB 15618—2018)。镉元素在地壳中含量极少，无单独的矿床，通常与Zn、Pb、Cu、Mn硫化物伴生。土壤中的重金属镉一方面是来源于岩石风化和火山活动等自然因素；另一方面则是由工业活动、污水灌溉、牲畜粪便、磷肥施用等人为因素导致[3]。因此金属硫化矿特别是铅锌矿区附近的农田土壤重金属镉污染尤其严重[4,5]。硫化尾矿中的镉在氧化条件下释放，随地表水迁移或渗入地下水，污染整个矿区甚至更大区域，最终可通过食物链的富集作用，影响动植物和人类健康[6-8]。国内外针对土壤镉污染修复进行了诸多尝试，如物理客土法、玻璃化法、电动修复法、化学淋洗、改良剂固定等，这些方法存在着修复成本高、易产生二次污染、易导致土壤退化等缺点，不适合大范围使用[9-11]；生物法如植物法吸收重金属有一定的效果，但也存在超积累植物品种的适应性、修复周期和效率问题的瓶颈[10]。数量庞大、种类繁多的微生物是生物地球化学循环的参与者，在土壤重金属的形态转化过程中扮演重要角色。采用微生物修复法操作简单、经济且环境友好，本文就近年来国内外有关土壤Cd污染的微生物修复方面的研究和实践进行综述。

1 镉污染土壤的微生物修复

土壤中的微生物无法直接分解重金属Cd，但微生物代谢产物及其代谢活动产生的能量可作用于Cd的氧化还原或沉淀过程，通过吸附、固定的方式稳定土壤中的重金属Cd，降低其迁移性和生物有效性；或改变镉的化学形态，影响其在土壤可溶相和不溶相之间的平衡，进而通过淋溶或植物吸收的方式去除。

1.1 吸附与固定

Cd的微生物固定化可以通过微生物作用下不溶性有机或无机化合物对Cd的沉淀或结晶，或微生物对Cd的吸附、吸收和细胞内隔离等来实现[12-13]。按照作用位置，又可分为胞外作用和胞内作用。

1.1.1 胞外作用

Cd2+的胞外作用是细胞表面的活性基团或胞外聚合物与Cd离子间发生的物理化学反应，包括静电吸附、离子交换和络合反应等[14]。外界环境中的Cd最先接触到微生物的胞外聚合物(EPS)。胞外聚合物是由多糖、蛋白质和少量的脂类、核酸等构成的有机高分子聚合物，胞外聚合物表面具有大量疏水区，且含有丰富的羧基、羰基、羟基、磷酰基、硫酸根、磷酸根等负电性官能团[15]，能够与Cd结合形成生物固定。付林波[16]对比提取EPS前、后的黄孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBKMF 1767(CCTCC AF96007))吸附重金属Cd的情况，发现未提取胞外聚合物的菌体吸附量明显优于提取后的菌体。魏德州等[17]采用透射电镜、红外光谱分析发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞与Cd离子的吸附过程主要与细胞多糖中的羟基、羧基及蛋白质中的氨基有关。Zhang等[18]采用透射电镜和X-射线能谱分析发现Cd在Burkholderiafungorum细胞表面的沉积，结合红外光谱分析和X射线粉末衍射揭示了胞外多糖对Cd的吸附效果。张海鸥等[19]发现深海菌株SCSE425-7的可溶性胞外多糖能提高细菌的抗Cd水平，菌株SCSE709-6产生的不可溶性的胞外聚合物能够有效螯合Cd离子。铁载体是微生物产生的低分子有机化合物，可在浓缩Fe转运进入细胞的同时通过络合作用影响Cd的生物可利用性。晋银佳等[20]证实荧光假单胞菌代谢产生的铁载体能够络合固定Cd2+，减少油麦菜对镉的吸收。

微生物细胞壁和细胞膜上存在的羟基(-OH)、羧基(-COOH)以及巯基(-SH)等活性基团可通过络合、配位结合以及离子交换等化合反应吸收Cd2+[21, 22]。Zhang等发现细胞壁上氨基基团会与Cd2+发生络合[18]。余雪梅等[23]用FTIR分析耐镉芽孢杆菌Bacillussp. PFYN01吸附Cd2+后的菌株表面，发现与Cd2+结合的官能团有酰胺基(N-H)、羧基(COOH)、羟基(O-H)、烃基(C-H)、羰基(C=O)等，说明细菌胞外的多聚糖、蛋白质和脂肪酸等参与了吸附过程。林雁冰[24]通过能谱分析发现放线菌细胞表面形成的沉积物中存在大量的Cd，红外光谱分析表明主要与-OH、-NH2、-COOH、-CO-NH-、-CN等功能基团有关。Huang[25]发现蜡状芽孢杆菌RC-1细菌的活细胞和死细胞对Cd2+都具有生物吸附能力，分别达24.01 mg/g和31.95 mg/g。

1.1.2 胞内作用

细胞内部作用主要是指微生物细胞对金属镉的累积。微生物利用细胞代谢活动提供的能量通过亲脂渗透、离子通道、细胞内吞、离子泵、络合后渗透、载体运输等机制将胞外Cd运输到胞内，然后经生物沉淀过程固定、储存在脂质囊泡，或与细胞内金属硫蛋白等发生结合转化[26]。Rani等[27]发现菌株Pseudomonasputida62BN能显著降低植物与土壤中Cd的含量，且P.putida62BN细胞内积累了大量的Cd。黄飞[28]发现在Cd2+浓度>20 mg/L时，蜡状芽孢杆菌(BacilluscereusRC-1)胞外Cd2+吸附量远大于胞内积累量，吸附过程以胞外吸附为主；而在Cd2+浓度<20 mg/L下时，胞内积累量大于胞外吸附量，吸附过程以胞内积累为主。金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一种半胱氨酸含量高、热稳定好的蛋白质，含有大量极易与重金属Cd离子结合的巯基[29]，与微生物对重金属的累积、及其重金属环境耐受能力等相关。Suleman等[30]发现金属硫蛋白基因重组大肠杆菌E.coliBL21 DE3对Cd2+的吸附量与比对照提高19倍。汤晓燕[31]将金属硫蛋白表达在酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞表面后，重组菌对Cd2+的吸附去除率提高了19.39%。张弛等[32]将融合表达金属硫蛋白基因的工程菌用于污水重金属处理，发现MT工程菌对Cd2+有较好的亲和性。Kuroda等[33]将酵母源金属硫蛋白展示在S.cerevisiae的细胞表面，其Cd2+的吸附能力提高到27.1 nmol/mg细胞干重，为对照的12倍。

1.2 溶解与活化

微生物的代谢活动产生大量的低分子有机酸，如甲酸、乙酸、柠檬酸、乙二酸、草酸等，这些有机酸改变土壤pH值，释放出可络合溶解的镉离子和含镉矿物中的镉元素，促进镉进入土壤液相，增加其迁移性，该方式有利于减少重金属对局部土壤的危害。早在20世纪80年代，真菌分泌的氨基酸、有机酸和其他代谢产物可以溶解重金属及含重金属的矿物就有文献报道[34]。Chanmugathas等[35]发现土壤微生物能够在土壤滤沥过程中通过分泌有机酸络合并溶解土壤中的重金属Cd。王京文等[36]研究发现接种耐镉菌株Arthrobactersp. m6后，矿区土壤中水溶态Cd增加2倍，可交换态增加16%，铁锰氧化物结合态和有机物结合态的Cd不同程度的下降，菌株使土壤难溶态Cd向生物有效态转化。Xu等[37]采用Cd污染土壤中分离到的异养菌和矿井酸性废水中分离到的自养菌混合浸出处理Cd重度污染稻田土壤，得到了较好的Cd去除率(32.09%)，且发现自养和异养菌株的协同代谢活性可能是除pH和ORP(氧化还原电位)外的Cd去除决定因素。Hao等[38]采用混合营养嗜酸菌的两步生物淋溶去除了污染稻田土壤总Cd的34%和有效Cd的87%，且盆栽实验接种混合菌的空心菜组织Cd浓度提高了78%。土壤中重金属常以硫化物或磷酸盐的形式存在，微生物分泌有机酸促进重金属硫化物或磷酸盐溶解获取硫和磷等营养元素的同时，也提高了生物有效态重金属的含量。杨卓等[39]发现巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)混合微生物制剂产生的有机酸能促进土壤有效态磷、钾的释放，使土壤中Cd的有效态含量提高15.02%，同时促进印度芥菜(Brassicajuncea)的生长及其地上部分Cd的含量增加17.93%。Wei等[40]发现富集的铁氧化微生物[主要为Alicyclobacillusferripilum(46.4%)和Alicyclobacillusaeris(35.6%)]浸出处理12 d可去除猪粪中90.5%的Cd，使生物有效磷含量上升25.9%，能较好地保留肥料性能且环境友好。

微生物具有较强的分解代谢能力和较高的代谢速率，修复重金属污染成本低，环境污染小，相关理论研究和实践探索已取得一定进展。但由于土壤微生物代谢活动对土壤环境条件变化的敏感，外源功能微生物对环境的适应、生长代谢调控、与土著微生物的相互作用等机制较为复杂，单纯的微生物技术在实地修复应用时往往与实验室结果出现较大差别。而微生物方法与其他修复方法的综合运用可克服单项修复技术的局限，提高污染土壤的修复速率与效率，成为近年来许多研究者新的选择。

2 微生物-植物协同修复

微生物-植物协同修复是利用植物及其相关微生物的相互作用规律来实现土壤镉污染的原位修复。微生物主要通过促进植物对Cd吸收，进而移除植物的可收割部分实现土壤重金属浓度的降低；或通过稳定土壤中的镉，以及抑制植物对镉的吸收而降低农作物中Cd的含量两种方式来实现，是一种较为“经济的、非侵入性”的方法[41]。

2.1 微生物促进植物生长和镉的累积

植物与其生长环境中的微生物关系密切。许多微生物进化出耐受高Cd2+浓度的能力，即使在高浓度的Cd环境下，抗Cd的植物促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)仍具有分泌吲哚乙酸、铁载体和ACC脱氨酶的能力，后者能促进植物生长获得更大的生物量和更好的Cd吸收效果，如黄文[42]从某矿区重金属污染土壤中分离筛选出一株能产生表面活性剂的假单孢菌属细菌Pseudomonassp. LKS06，在促进龙葵的生长同时显著提高植物对镉的富集能力，使其根和地上部镉的总累积量最高分别比对照增加36.7%和42.4%。嗜酸性微生物的活动往往改变土壤的酸碱环境，有利于重金属Cd的溶解和迁移，如刘卫敏[43]添加氧化亚铁硫杆菌菌液到矿区土壤盆栽的黑麦草，显著増加了根际土壤的酸溶态Cd含量，且黑麦草地上和地下部分Cd含量最大增量分别达347.45%和743.94%。与植物共生的微生物如菌根真菌等在帮助植物在促进宿主营养吸收的同时，有可能将积累的Cd转移到高等植物中，如高玉倩[44]接种浓度2.5%的丛枝菌根真菌摩西球囊霉菌根(Glomusmosseae)促进了鸭跖草对尾矿中Cd的吸收。

2.2 微生物抑制植物对Cd的吸收

重金属镉对人类健康的最大威胁来自食物链的累积，因此，降低农作物可食用部分镉的积累是解决镉污染土壤持续安全生产的有效途径之一。丛枝菌根真菌可将镉转化为毒性较小的不活跃形式来增强水稻抗Cd的能力，通过菌丝将镉滞留在根部抑制其转移，同时还能改善植株的磷营养状况，增加根系磷的吸收[45]。罗方舟等[46]发现接种丛枝菌根真菌摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)能同时降低旱稻对Cd的富集和转运能力，从而显著降低其各部分Cd含量，特别是籽粒中的Cd含量被降低了26.8%～57.1%。Li等[47]发现水稻(OryzasativaL.)与两种丛枝菌根真菌Rhizophagusintraradices(RI)和Funneliformismosseae(FM)共生能够降低植株地上部和根系的Cd浓度，缩小在植株嫩枝和根部中无机态和水溶性态Cd的浓度和比例。胡振琪[48]研究发现，接种丛枝菌根真菌Glomusdiaphanum使玉米的生物量增加了5.79倍，地上部分镉含量降低了53.9%，地上部分磷含量增加了4.6倍。

微生物-植物共修复可以弥补微生物修复技术与植物修复技术两者在土壤污染物修复中的不足,提高生物修复效率，但实际应用中构建合适的微生物和植物的修复模式是其重点和难点[49]，离大规模推广尚有一定距离。

3 微生物-土壤调理剂联合修复

添加土壤调理剂的原位稳定化技术是目前修复重金属污染土壤中较普遍且廉价高效的技术之一。土壤调理剂可通过沉淀、吸附、络合或氧化还原作用调控土壤的理化性质，从而改变土壤中重金属的赋存形态，降低其生物有效性、水溶性及扩散性等性质，减少重金属对土壤环境的危害和影响；同时，土壤微生态环境和土壤微生物群落多样性也得到改善和提高[50]。土壤微生物是表征土壤功能的敏感指标，微生物数量的增加和多样性的改善对土壤解毒和植物生长有促进作用，因此，微生物菌剂配合土壤调理剂使用，是土壤重金属污染修复特别是农业用地修复的有效的战略之一[51]。

常用的土壤调理剂有黏土矿物、磷酸盐化合物、石灰、金属氧化物、有机废物和生物炭等。功能微生物联合生物炭(Biochar，BC)使用，近年来在重金属污染土壤修复应用领域备受关注[52-54]。生物炭是厌氧或限氧条件下生物质热转化的富碳材料，一般为碱性，且具有多孔结构、比表面积大、表面活性位点多等特点，能够调节土壤pH值，有很强的重金属吸附亲和力[55]。研究表明，作为土壤调理剂，生物炭可通过表面丰富的羟基、羧基和酚基以及芳族结构上的π电子富集域等有机官能团来捕集可溶性Cd，从而降低其迁移率和生物利用度[55-57]。生物炭的多孔性和表面特性可为土壤微生物生长与繁殖提供良好的栖息环境与养分，增加微生物丰度，因此，生物炭的加入可改变土壤性质、土壤酶活性和微生物群落结构[58]，对重金属污染土壤的原位生物修复有积极意义。Tu等[59]以玉米秸秆生物炭负载耐重金属假单胞菌Pseudomonassp. NT-2作用于污染矿山土壤，75 d盆栽试验结果表明，5%生物炭菌剂的施用可使土壤pH维持在7.2～7.5之间，与单一生物炭调理剂相比可显著提高Cd残渣态的比例、降低可交换态和碳酸盐结合态的比例。Wu等[60]把植物促生菌Serratiamarcescensstrain SNB6成功地固定在生物炭上组合成复合生化材料(BCM)，并结合超累积植物香根草(ChrysopogonzizanioidesL.)构建了生物炭-促生菌-超累积植物的土壤重金属镉污染修复体系，该体系显著可提高土壤可提取态Cd的比例、香根草的生物量和镉含量，同时生物炭与菌株表面的官能基团也有助于Cd的固定化，为重金属Cd的现场治理提供了一条新的途径。但由于目前关于生物炭异质性、环境稳定性以及对其他环境因子的影响机制的研究还有待完善[61,62]，微生物与生物炭在土壤修复过程中的作用机制及效果等还有待进一步研究。

4 展望

土壤镉污染是一个全球性问题。由于镉在地壳中含量极少，通过微生物活动改变土壤结构、pH值、氧化还原态、土壤酶等物理生化性质影响重金属Cd的溶解性和生物有效性，实现土壤原位修复的是相对经济、环境友好的选择。综观国内外有关研究，筛选具有一定Cd耐受能力的功能微生物，对其在Cd的吸附、固定或者促进溶解改变Cd的生物有效性方面的功能、以及在一定环境下与其他微生物互作来实现土壤重金属Cd修复的过程进行研究，仍是当前该项技术的关键。由于矿山土壤环境的特殊性，矿山及周边重金属污染往往是伴生的多种重金属的复合污染，有些区域还受到选矿药剂的影响，如铅锌矿周边Cu、Cd、Pb、Zn、As等重金属污染可能同时存在且相互影响，Cd、As在土壤中具有相反的地球化学行为[63]等，单一微生物菌剂的使用或单纯的微生物修复方法难以在实际应用中达到理想效果，多种方法的联合使用来提高修复效率，如利用根际和共生微生物与超累积植物的互作或采用土壤调理剂(如生物炭等)与功能微生物配合使用等，具有较大发展空间。此外，随着基因工程和纳米技术的发展，在风险可控的前提下采用转基因方法将重金属Cd抗性基因引入微生物细胞及其相关植物细胞，表达天然螯合剂、功能蛋白质或与Cd的形态转化相关的酶等来增强功能微生物的修复能力，也将是重要发展方向。